<b><font color="#0070C0">专题一　微生物培养基的配制</b></font>
<b>一、实验目的</b>
体验培养基的配制过程，了解常用的灭菌方法。
 
<b>二、实验原理</b>
微生物的生长繁殖需要各种营养物质，一般包括水、无机盐、碳源和氮源，有的还需要少量特殊营养物质(如生长因子)。根据微生物的种类和实验目的不同，选择不同的原料配制不同培养基。本实验使用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为细菌提供碳源和能源、磷酸盐、维生素；蛋白胨主要提供氮源；而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入琼脂作凝固剂。在培养细菌时要用稀酸或稀碱将pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
配制好的培养基必须经过灭菌才能获得纯净培养物。根据不同的材料和目的，人们采用不同的灭菌方法。实验室对微生物培养的器皿、接种用具和培养基常用高压蒸汽灭囷法。
 
<b>三、基础知识</b>
1.培养基的类型及其应用
培养基是为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。
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2.培养基配制的原则
(1)目的要明确：根据微生物对培养基营养物质的不同需求，来确定培养基的原料组成、物理性质、化学成分等，如自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类、蛋白质、维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以由简单的无机物组成，在配制过程中不加入其他碳源物质，而是依靠空气中和溶于水中的CO<sub>2</sub>为微生物提供碳源。
(2)营养要协调：一是营养物质的浓度要适宜，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制生长繁殖作用。二是营养物质间的浓度比例要适宜。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的代谢和产物的形成和积累。
(3)pH要适宜：各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，如细菌与放线菌适于在pH7～7.5范围内生长，酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6范围内生长。为了维持培养基中pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，最常用的缓冲剂是磷酸氢二钾和磷酸二氢钾组成的混合物。
3.无菌技术
无菌操作原理是针对不同对象采用不同的消毒和灭菌的方法，在高温、高压、化学药剂、强酸和强碱作用下，使微生物蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。
无菌操作包括：
(1)对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；
(2)将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；
(3)为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；
(4)避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
4.灭菌与消毒
灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。
消毒是使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物问题探讨。方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒和紫外线消毒等。
 
<b>四、实验操作</b>
1.配制培养液
在200mL烧杯中加入100mL蒸馏水，再加入天平称取的0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、l.5g琼脂，边加热边搅拌，配制成培养液。
2.调节pH
采用pH试纸(或pH计)测试并调节培养基的酸碱度。先用玻璃棒沾取培养基测试其pH，再根据实际情况用质量分数为3%的NaOH或HC1溶液将其pH调至7.2。
3.分装
将培养基趁热分装到洁净的试管中，培养基的高度约为试管垂直高度的85520。注意分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。然后在试管口加上棉塞，棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好，注意棉塞长度的85842在试管口内。
4.包扎
将3～5支试管扎成一捆，外包1层牛皮纸或2层报纸，用线扎好。在试管壁上注明培养基的名称、组别、配制日期等。
5.灭菌
用高压蒸汽灭菌锅在温度为121℃、气压为100kPa的条件下灭菌20min。切断电源，待压力表中指针指向“0”点、温度降至100℃以下后，取出灭菌物品。
6.搁置斜面或倒平板
待试管冷却至50℃左右，将试管口部枕在高约1cm的木条或其他合适高度的物体上，使其自然倾斜，斜面长度不超过试管总长的86238。
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的过程如下：
(1)将灭过菌的培养皿放在酒精灯火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。
(2)右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
(3)用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒人培养基，左手立即盖上培养皿的皿盖。
(4)等待平板冷却凝固(约需5～10min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
 
<b>五、注意事项</b>
1.配制培养液的过程中，溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或糊底引起烧杯破裂；加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度；培养基各种成分融化后灭菌前要根据培养微生物的需要调节pH。
2.使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌，灭菌完成后要等压力表中读数为“0”、温度降至100℃以下后，先放气再打开灭菌锅盖。
3.检验培养基的制作是否合格，如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天后无菌落生长，说明培养基的制作是成功的，否则需要重新制备。
 
<b>六、仪器使用</b>
手提式高压蒸汽灭菌锅使用方法：
(1)在外层锅内加适量的水，将需要灭菌的物品放人内层锅，盖好锅盖并对称地拧紧螺旋。
(2)加热使锅内产生蒸汽，当压力表指针达到33.78kPa时，打开排气阀，将冷空气排出，此时压力表指针下降，当指针下降至零时，待空气排完后，将排气阀关好。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气的蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
(3)继续加热，锅内蒸汽增加，压力表指针又上升，当锅内压力增加到所需压力时，将火力减小，按所灭菌物品的特点，使蒸汽压力维持所需压力一定时间。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热好，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1g水100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
(4)取出灭菌物：将灭菌锅断电或断火，让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
 
<b>七、思考探究</b>
1.细菌培养基中的牛肉膏和蛋白胨可以提供哪些营养物质？
牛肉膏中富含水溶性糖类、有机氮化合物、维生素、盐等物质，蛋白质胨中富含有机氮化合物、一些维生素和糖类物质。
2.高压灭菌锅在使用前后有哪些注意事项？
使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌，灭菌完成后要等压力表中读数为“0”、温度降至100℃以下后，先放气再打开灭菌锅盖。
3.为什么灭菌前需要调节培养基的pH？
因为微生物的种类不同，适宜它们生活的pH范围不同，一般来说，细菌、放线菌、真菌生长的最适pH分别为6.5～7.5、7.5～8.5、5.0～6.0。
4.为了能彻底灭菌，在操作过程中应注意哪些事项？
操作过程保证无菌操作，防止杂菌污染。例如对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具等器具进行灭菌；为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
5.如何检测已灭菌的培养基是无菌培养基？
将灭菌后的培养基空白培养。即将其放在37℃培养箱中，经24h培养，若无菌生长，可保存备用。
6.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被外来微生物污染外，还有什么作用?
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
7.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来估计培养基的温度？
可以用手触摸锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
8.平板冷凝后，为什么要将平板倒过来放置?
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养皿表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

<b><font color="#0070C0">专题二　大肠杆菌的接种与分离培养</b></font>
<b><font color="#00B050">实验一　斜面接种和培养大肠杆菌</b></font>
<b>一、实验目的</b>
1.体验斜面接种技术和微生物培养的过程。
2.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
 
<b>二、实验原理</b>
在无菌条件下，将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法也不同，如斜面划线接种、平板划线接种、涂抹平板接种等，其核心都是要防止杂菌污染，保证培养物的纯度。因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针(穿刺接种用)、接种环(划线接种用)和玻璃刮铲(涂抹平板用)等。
斜面接种技术是指由已长好微生物的斜面中挑取少量菌种接种至另一空白斜面培养基上。
 
<b>三、基础知识</b>
1.斜面接种技术
(1)基本方法是用接种环或接种针伸人菌种管内，挑取用来移种的菌落(如大肠杆菌)。伸人斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上地蜿蜒划线。接种过程必须在无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37℃恒温培养箱中培养24h后，置于4℃冰箱中保存。
(2)斜面接种技术的主要目的有菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。
2.培养大肠杆菌的条件
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响。微生物种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。
(1)营养物浓度：细菌生长需要能量，称为维持能。随着营养物浓度的增加，生长率愈接近最大值。但营养物浓度过高，会使细菌脱水死亡。
(2)温度：在一定的温度范围内，每种微生物都有生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。如大肠杆菌的最适培养温度为37℃左右。
(3)水分：水分是微生物进行生长的必要条件。微生物不能脱水而生存的，只能在水溶液中生长，也不能生活在纯水中。
(4)氧气：按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为需氧微生物、兼性需氧微生物、微量需氧微生物、耐氧微生物、厌氧微生物。
 
<b>四、实验操作</b>
(―)接种前准备工作
接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。
(二)接种过程
1.点燃酒精灯后，取两支盛有培养基的试管，其中一支为内有菌种的菌种管，另一支是盛有已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的斜面培养管。将菌种管和待接种的斜面培养管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位，掌心向上，管口齐平并朝向小拇指方向。试管内斜面向上，并使它们位于水平位置。
2.先用右手将棉塞或硅胶塞旋松，以便接种时容易拔出。右手持接种环(如握钢笔一样)，将接种环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次，烧红灭菌。
3.在火焰附近用持有接种环的右手的小指、无名指、中指和手掌边先后拔出菌种管和待接种的斜面培养管的棉塞或硅胶塞，然后让试管口通过火焰2～3次，以杀灭试管口上沾染的微生物，不能烧得过烫。
4.将灭菌后的接种环缓缓伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端没有长菌的部位使其冷却，再轻轻挑取少许菌体，然后将接种环移出接种管。
5.在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接种的斜面培养管中。从斜面培养基的底部向上作“S”或“Z”形蜿蜒划线，将菌种接种到斜面培养基上。也可用接种针在斜面培养基的中央拉一条线，再自下而上蜿蜒划线，作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
6.右手先取出接种环，将接种后的接种环多次灼烧，冷却后放下。左手持试管，将试管口通过火焰2～3次，右手持棉塞或硅胶塞也须迅速通过火焰2～3次，迅速塞紧试管。塞棉塞时，不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。
7.将接种过菌种的试管放在37℃恒温培养箱中培养24h后，置于4℃冰箱中保存。
(三)观察记录
将观察到的大肠杆菌的菌落特征记录于下表中。
86590
 
<b>五、注意事项</b>
1.标签贴在距试管口以下2～3cm的位置，避免灼烧试管口时被烧着。
2.在抽出接种环时，注意带菌部分不要触及管壁或通过火焰。
3.划线时不要将培养基的表面划破。
4.实验后的菌种管统一集中起来，进行高压蒸汽灭菌后再丢弃，以免造成环境污染。
 
<b><font color="#00B050">实验二　平板划线和分离大肠杆菌</b></font>
<b>一、实验目的</b>
1.简述无菌技术的概念与含义。
2.简述培养基的用途和种类。
3.尝试通过平板划线法纯化一种微生物。
 
<b>二、实验原理</b>
微生物的分离就是将待检测的微生物样品通过划线或涂布接种在固体平板培养基上，在高度稀释条件下，使样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。
用接种环蘸取菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，微生物细胞也逐渐减少。划线到最后，可使细胞间的距离加大。在培养一定时间后，可由一个细胞产生单菌落，菌落不会重叠。
 
<b>三、基础知识</b>
除了试管斜面划线法外，纯化和培养微生物的方法还有平板划线法、涂布平板法问题探讨等。
平板划线法是指用带有微生物的接种环在培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。
 
<b>四、实验操作</b>
1.在一个倒有培养基的培养皿的皿底外侧面中央用记号笔画一直线，再在此线中间处画一垂直线，分成三个区域：第1区域、第2区域、第3区域，分别标上“1”、“2”、“3”字样(如图1)。
2.接种划线时，将带有微生物样品的接种环，在培养皿内培养基的第1区域划线，然后再从第1区域划到第2区域，从第2区域划到第3区域。在固体培养基表面完成多次“由点到线”的逐步稀释(如图2)。接种和划线操作时需要在酒精灯火焰附近进行。
3.通过培养可以得到由单个细菌增殖而形成的菌落。
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<b>五、注意事项</b>
1.灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板和斜面，最好空培养一天，观察有没有灭菌彻
底，如果有杂菌出现，需重新制作。
2.划线法分离时要注意，每次取菌种前都要灼烧接种环，第一次划线前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物，后两次划线前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的残留菌种。
3.取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种。最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。划线时不要划破培养基，如果采用分区划线法操作，第二次操作应该从上一次划线末端开始，首尾区不能相连。整个操作过程必须始终在酒精灯火焰旁进行。
 
<b>六、仪器使用</b>
接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红(接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次)，冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。
 
<b>七、思考探究</b>
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
 
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线?
以免接种环温度太高，杀死菌种。
 
3.为什么接种操作通常在酒精灯火焰附近进行?
因为酒精灯火焰附近的局部高温使微生物难以存活。
 
4.在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上划线接种，24h后你肉眼观察到的大肠杆菌的菌落形态有什么特征？
实验24h后，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上的大肠杆菌的菌落，肉眼观察是圆形，边缘整齐，表面光滑，有小凸起，颜色为半透明，略呈乳白色。
 
5.将带菌种的接种环伸入待接种的试管中，在培养基斜面上由底部向上轻轻划“S”型曲线，将菌种接种到培养基上，为什么不划直线？
划“S”型曲线能增加菌种在培养基上的接种数量。
 
6.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线?
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
 
7.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理?
实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。

<b><font color="#0070C0">专题一　微生物培养基的配制</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　高温灭菌的原理是(　　)
A．每种微生物生长的最适温度是一样的
B．微生物不适合高温环境
C．高温破坏了蛋白质、核酸，影响其生命活动
D．高温降低了环境中氧的浓度
<b>答案：</b>
<b>解析：</b>蛋白质和核酸等物质在高温条件下，可发生不可逆的变性。通过高温处理，使微生物细胞中的蛋白质和核酸等物质高温下变性失活，从而达到灭菌的目的。
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　(多选)下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，正确的是(　　)
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．从灭菌箱中取出培养基后，迅速进行倒平板
D．待平板冷却凝固约10～15min后将平板倒过来放置
<b>答案：</b>
<b>解析：</b>制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的正确步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。牛肉膏容易吸潮，所以将牛肉膏和称量纸一同放入烧杯加热，待牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。从灭菌箱中取出培养基后，不能迅速进行倒平板，需待培养基冷却至50℃左右，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态。
 
<b><font color="#0070C0">专题二　大肠杆菌的接种与分离培养</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　在细菌培养实验中，要在试管口加塞棉塞，下列叙述正确的是(　　)
A.紧紧塞住，不能漏气，棉塞长度104253在试管内
B.比较膨松，留有缝隙，保证通气良好
C.不松不紧，没有缝隙，既能防止杂菌的污染，又保持通气良好
D.棉塞长度104680在试管内，方便拔取
<b>答案：</b>
<b>解析：</b>用棉塞塞试管口时，不宜过紧或过松，以不留缝隙为宜，棉塞过紧，会妨碍空气流通，不易拔出；棉塞过松，微生物可以从缝隙处进入，导致污染。加棉塞时，应使棉塞长度的105069留在试管内，不松不紧，既能防止杂菌的污染，又保持通气良好。
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是(　　)
A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
C.在第二区域内划线时，用于划线的菌种直接来源于第一区域划线上的菌液
D.划线结束后，用酒精擦拭接种环后，放回盒中
<b>答案：</b>
<b>解析：</b>划线结束后，应灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

<b><font color="#0070C0">专题三　以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离、培养与数目测定</b></font>
<b>一、实验目的</b>
研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。
 
<b>二、实验原理</b>
1.选择培养分离菌株
科学家针对某种微生物有特殊的营养需求或对化学物质有不同的敏感性的特性，设计一个特定的环境，使之非常适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。
2.统计菌落数目
(1)测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌数目的原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(3)显微镜直接计数法统计样品中菌体数目的原理：
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下直接计算一定容积的样品中微生物的数量。
 
<b>三、基础知识</b>
1.筛选菌株
(1)选择培养分离：
微生物的选择培养是利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术。
(2)选择培养基：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。配制选择培养基是根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。本实验提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，原则上只能够利用尿素的微生物有才能生长。但实际上有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定(选填“一定”或“不一定”)是所需的微生物，还需要进一步培养和验证，才能筛选出所需菌株。
2.统计菌落数目
(1)常用方法：涂布平板法、显微镜直接计数法，还可以用过滤膜法。
(2)涂布(抹)平板法(也叫活菌计数法)。
许多细菌、真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的方法很容易得到它们的纯培养物。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基的表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落。
分离和培养微生物常用的是琼脂固体培养基。平板分离法有多种，实验室中最
常用的两种方法是涂抹平板法和混合平板法。
(3)显微镜直接计数法：
血球计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm<sup>2</sup>，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中格，每个中格再被分成16个(或25个)小格，每个计数室都由400个小格组成。计数室总体积为0.1mm<sup>3</sup>。
计算公式：
1mL悬液中待测标本(菌体)总数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。
 
<b>四、实验操作</b>
(一)涂抹平板法培养和计数土壤微生物
1.制备土壤稀释液
(1)采样：
选择湿度较大，土质较疏松，腐殖质较多的土壤，拔开地表的落叶和其他杂质，取土壤表层以下5～10cm处的土样，放人灭菌袋或灭菌过的牛皮纸信封，带回实验室备用。
(2)溶解与稀释：
称取土样0.5g，放人盛有50mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床振荡(200r/min)20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，制成10<sup>－2</sup>g/mL的土壤悬液。
用移液管吸取0.5mL土壤悬液加入盛有4.5mL无菌水的试管中充分混匀，制成10<sup>－3</sup>g/mL的土壤稀释液。然后用移液管从10<sup>－3</sup>g/mL土壤稀释液中吸取0.5mL加入另一只盛有4.5mL无菌水的试管中充分混匀，以此类推，制成10<sup>－4</sup>g/mL、10<sup>－5</sup>g/mL、10<sup>－6</sup>g/mL、10<sup>－7</sup>g/mL、10<sup>－8</sup>g/mL不同浓度的土壤稀释液。
2.制备以尿素为唯一氮源的选择培养基平板
按下表的微生物培养基本配方，制备培养基平板：
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将已灭菌的培养基溶化，冷却到45～50℃，倒入不同编号的培养皿中，迅速盖好培养皿盖，待凝固后即成平板。另设置一份不加氮源的作为空白对照(以等体积的无菌水代替)。
3.分组编号
取已灭菌的选择性琼脂培养基平板18个，在每只平板的底面分别用记号笔写上组别和浓度，如第1组10<sup>－3</sup>(1)、第1组10<sup>－3</sup>(2)、第1组10<sup>－3</sup>(3)、……第6组10<sup>－8</sup>(1)、第6组10<sup>－8</sup>(2)、第6组10<sup>－8</sup>(3)。
4.涂布法接种分离
用移液管吸取10<sup>－8</sup>g/mL的土壤溶液1mL，在酒精灯附近，左手将培养皿打开一条缝隙，右手持移液管将1mL10<sup>－8</sup>g/mL的土壤溶液注人到编号为第六组10<sup>－8</sup>(1)的平板上。再重复操作17次，依次将10<sup>－8</sup>、10<sup>－7</sup>、10<sup>－6</sup>、10<sup>－5</sup>、10<sup>－4</sup>、10<sup>－3</sup>由低到高的稀释浓度的土壤溶液，分别注人相应编号的17个平板上。每一浓度更换一支移液管。
将浸在酒精中的玻璃涂布器取出，在酒精灯火焰上引燃，待残留在涂布器上的残留的少量酒精燃尽后，冷却8～10s。
在酒精灯附近，左手将平板培养的皿盖打开一条缝隙，右手持涂布器，将菌液均匀地涂布在平板培养基的表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
在室温下，将培养皿正放静置5～10min，使菌液充分吸附进培养基。
5.培养
将涂布静置后的18只培养皿，轻轻倒置，移入37℃培养箱中培养1～2天。
6.观察和统计
观察各组平板上的不同菌落的特征，如菌落的形态、大小、隆起程度和颜色等，并记录在下表：
159137
统计各组平板上的菌落的种类和数目。确定一个菌落数为30～300的一组，描述与记录该菌落的特征，作为目的菌落，进行计数，并准备用于纯培养。
每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度重复培养后的菌落平均数×10÷稀释浓度(或×稀释倍数)
注：①涂布时所用的稀释液为1mL；
②第1组的稀释浓度为10<sup>－3</sup>g/mL，稀释倍数10<sup>3</sup>，依次类推。
(二)显微镜直接计数法
1.将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物悬液，在盖玻片的边缘，滴一小滴，让菌液沿着缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。
2.加样后静置5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，再换成高倍镜进行观察和计数。
3.计算时，选取4个中格(16×25型)或五个中格(25×16型)的菌体进行计数。分别记录所数中方格中的菌体数，再计算出平均值，乘以400，算出大方格中的菌体总数，然后换算出1mL悬液中的菌体总数。
 
<b>五、注意事项</b>
1.采样时选择取样地点要适合。不同土壤的生态条件不同，微生物的种类和数量存在差异，因为土壤的结构和肥力影响微生物的生存，所以要选择湿度较大，土质较疏松，腐殖质较多的土壤，去除表层5～10cm的土样。放人灭菌袋或灭菌过的牛皮纸信封，目的是排除无关变量的干扰，保证分离出的微生物是来自土壤。
2.涂抹接种时，每次吸取土壤悬液前，都要将悬液充分振荡混合均匀。制备土壤稀释液时，移液管需要经过灭菌。操作时试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2cm处。
3.为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
4.灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板和斜面，如果条件允许，最好空培养一天，观察有没有灭菌彻底，如果有杂菌出现，需重新制作。
5.涂布法分离时要注意，玻璃涂布器末端是浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中，取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。操作中一定注意防火！不要急于将过热的涂布器放回盛放酒精的烧杯中，以避免引燃其中的酒精。
6.血球计数板计数时，土壤微生物悬液经过稀释后，一般要求达到每小格内有5～10个菌体为宜。
7.血球计数板计数时，对于格线上的菌体一般只计数上方和右边格线上的。
8.血球计数板使用完毕后，需用水反复冲洗，切勿用硬物洗刷。洗完后自行晾干即可。
 
<b>六、思考探究</b>
1.本实验所用的选择培养基的配方中，为微生物生长提供碳源和氮源的是什么物质？
葡萄糖、尿素。
 
2.绝大多数的微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，请分析该培养基是否对微生物有选择作用？如果有，是如何进行选择的？
有选择作用。在这样的培养上，能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用氮源，即培养基允许这些特定种类的微生物生长，形成一定数量、形态特征的菌落。而其他不能合成脲酶的微生物，则因不能利用氮源而被抑制或阻止生长。
 
3.如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数?
统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按以下公式进行计算：每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度重复培养后的菌落平均数×10÷稀释浓度(或×稀释倍数)。
 
4.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的(例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万)。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
 
5.涂布接种分离法和显微镜直接计数法的主要区别是什么？
涂布接种分离法主要是计数活菌数目，而显微镜直接计数法不能区分死菌与活菌，通常需要用活体染色后计数。

<b><font color="#0070C0">专题三　以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离、培养与数目测定</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　通常用来作为菌种鉴定的重要依据是(　　)
A．菌落
B．细菌形态
C．细菌体积
D．细菌结构
<b>答案：</b>A
<b>解析：</b>细菌个体非常小，不易直接观察。不同细菌的菌落形态特征不同，可以用肉眼观察，因此菌落常作为鉴定菌种的依据。
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　在涂布平板操作时，错误的是(　　)
A．取少量菌液滴加在培养基表面
B．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红再使用
C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却8～10s再用
D．涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
<b>答案：</b>B
<b>解析：</b>涂布平板时，首先要对涂布器进行灭菌处理，方法是把沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上点燃，冷却后使用；然后把0.1mL的菌液滴加到平板上，用涂布器涂布均匀。如果涂布器在酒精灯火焰上灼烧直到烧红，不经冷却，则涂布器的温度很高，在使用时就会杀死要接种的细菌。
 
<b><font color="#0070C0">例3</b></font>　某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。实验的主要步骤如下。请分析回答问题：
(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选______，这种培养基属于______培养基。
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的________，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是________。
(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量______的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量______。
(4)转为固体培养时，常采用______的方法接种，获得单菌落后继续筛选。
(5)若要研究“目的菌”的生长规律，可将单个菌落进行液体培养，稀释后采用________或________进行计数，以时间为横坐标，以__________为纵坐标，绘制生长曲线。
(6)实验结束时，使用过的培养基应该进行______处理后，才能倒掉。
<b>答案：</b>(1)“目的菌”　　选择
(2)化合物A　　异养需氧型
(3)减少　　增加
(4)平板划线
(5)稀释涂布平板法　　显微镜直接计数法　　“目的菌”数目的对数
<b>解析：</b>题干中首先说明了化合物A是有机物，后来在培养基中又增加了磷酸盐、镁盐以及微量元素，通过比较各培养瓶中化合物A的多少，选出“目的菌”，由此还可推断出“目的菌”所需碳源和氮源都来自化合物A，是异养型。获得“目的菌”后，再进行扩大培养，培养过程中及培养结束后注意灭菌。

<b><font color="#0070C0">专题四　天竺葵的组织培养</b></font>
<b>一、实验目的</b>
1.简述植物组织培养的基本原理。
2.熟悉并掌握植物组织培养的基本方法和步骤，尝试进行植物组织培养。
 
<b>二、实验原理</b>
植物组织培养是指在无菌和人工控制(如一定的营养和激素等)的条件下，诱导离体的植物器官、组织等(称为外植体)在适宜的培养条件下发育成完整植株的技术。植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性。从植物体上分离出来的一部分器官、组织或除去细胞壁的原生质体，在无菌和适宜的营养等条件下，全能性就会表现出来。
 
<b>三、基础知识</b>
1.培养基贮备液的配制
离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配置适宜的培养基，常用的一种培养基是MS(Murashige&Skoog，1962)培养基。由于MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的10倍或100倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液或培养基贮备液。
2.细胞的全能性(cell　totipotency)
植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。
在生物体内细胞并没有表现出全能性的原因是：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达，细胞分化形成不同的组织、器官。
3.植物组织培养的基本过程
187953
4.几个基本概念
愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化或去分化。
再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。
4.植物组织培养成败的主要影响因素
影响植物组织培养成败的因素有很多，主要有外植体的选取、营养因素、环境因素(温度、pH、光照)、植物激素的种类和配比等，此外，在实验过程中的消毒、灭菌、接种、培养、移栽和栽培等实验操作也非常重要。
5.植物组织培养的实验流程
制备MS培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培。
 
<b>四、实验操作</b>
(一)组织培养
1.准备：
(1)器具准备：
高压蒸汽灭菌锅；超净工作台；接种工具；培养设备；化学实验及分析设备。
(2)试剂准备：
试剂：MS基本培养基贮备液(按教科书上表I一I配制并保存在4℃冰箱中)，漂白粉或次氯酸钠(NaCIO)，2，4－D，萘乙酸(NAA)，6－苄氨基嘌呤(6－BA)等。
2.配制：按表I－I中最右栏的标准分别取4种贮备液，加入2000mL烧杯中，再称取蔗糖30g、琼脂8g加入烧杯，加蒸馏水定容至1000mL，加入煮沸至琼脂完全溶解，用质量分数为10％的NaOH溶液调节pH至5.6～5.8，即成MS基本培养基。在此基础上，再配制如下培养基：
①诱导愈伤组织的培养基：MS十0.5mg/L　6－BA＋0.125mg/L　2，4－D
②分化芽的培养基：MS＋1.0mg/L　6－BA＋0.1mg/L　NAA
③生根的培养基：MS＋0.1mg/L　NAA
上述培养基的配制分别添加植物激素后搅拌均匀，再次定容并调节pH。用漏斗将上述各种培养基分别装入若干个50mL锥形瓶中(每瓶约装20mL),塞上棉花塞，并用牛皮纸包扎。
3.灭菌：
(1)培养基灭菌：将培养基置于121℃温度下湿热灭菌20min，冷却后置于30℃的培养室中观察3天，以检查是否灭菌彻底。
(2)外植体灭菌：
取天竺葵幼嫩的叶→流水冲净→滤纸吸去表面水分后，在质量分数为10％的漂白粉溶液或质量分数为2％的NaClO溶液中浸泡5～15min→无菌水冲洗4～6次(2min1次)。
4.接种：在超净工作台上的无菌培养皿中用手术刀将叶片切成0.5cm<sup>2</sup>的小方块(外植体)，接种于培养基①中培养。用无菌棉塞塞紧瓶口，并用牛皮纸包扎好，或将植物培养的专用瓶盖好。在培养瓶上贴上标签，写明组织培养的材料名称、接种日期和接种人姓名或小组序号。
5.培养。①初代培养：在15℃、光照强度为1000～2000lx的条件下，每天光照12h，培养10天左右。每天观察外植体的生长情况，记录愈伤组织的大小、质地、颜色等。
②转接培养(继代培养)：10天后，将增长至一定体积的愈伤组织转接到培养基②上，在15～25℃、光照强度为1000～2000lx的光照培养箱内继续培养。待愈伤组织分化出幼芽后，再转接到培养基③上诱导生根。
(二)露地栽培
1.培育壮苗：在培养基中添加一定数量的生长延缓剂(如多效唑、矮壮素等)，使试管苗的茎增粗、根数增加、叶绿素含量增加等。同时，打开或半打开瓶塞或封口膜，逐渐加强光照，以逐步适应外界环境，这一过程约需1周时间。
2.洗净琼脂培养基：把试管苗从试管或培养瓶中移出时，要细心洗去黏附在根系上的琼脂培养基，防止移栽后因霉菌侵染而导致烂根、植株死亡。
3.选用合适的移植基质：选择排水性和通气性好的材料(如蛭石、珍珠岩、腐殖土等)作为移植基质，并进行消毒。
4.移栽后条件控制：在移栽后的前1～2周，要保持空气湿度在90％～100％。在高温和强光的条件下要用遮阳棚降低温度和遮挡强光，并用喷水雾的方法增加空气湿度，控制土壤温度。
 
<b>五、注意事项</b>
1.应选择长势好、无病虫害、健康植株的叶片作为外植体。
2.要在避光条件下诱导培养愈伤组织。
对于植物组织培养来说，光照条件非常重要，包括光照强度、时间和波长。但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养，而在分化再生的过程中一定要有光照。愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。
3.无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键。
由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高，对无菌操作的要求非常严格。如果不小心引起污染，将可能造成培养工作的前功尽弃。无菌技术包括培养基灭菌和植物材料(外植体)的消毒灭菌。对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。
在操作接种过程中要多次火焰消毒镊子和解剖刀，冷却后再使用。注意接种时使培养容器成一定的倾斜度，用手拿镊子的接种过程不要直接在培养基上方完成，以减少污染机会。
4.妥善处理被污染的培养物。
造成培养基污染的因素有很多，一般包括：外植体带菌、培养瓶和各种器械灭菌不彻底、操作人员操作不规范等。一般情况下，细菌污染可能是由接种人员造成的，如未戴口罩，接种时说话，或手及器械消毒不严等。真菌污染可能是植物材料灭菌不当。需要特别注意的是，一旦发现培养材料被污染，特别是真菌性污染，一定不要打开培养瓶。应先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗。
5.有毒药品的用后处理。
外植体灭菌用过的有毒药品要妥善处理(如氯化汞等)，以免引起环境污染。一般应收集后统一交给有关专业部门处理。
6.试管苗移栽前要驯化。
由于试管苗是在无菌、有完全营养、适宜的光照和温度以及高湿(100％相对湿度)的环境中生长的，植物表面没有蜡质和角质层等保护组织，气孔不具有关闭功能，有叶绿体但自养能力差，这样的试管苗如果不经过炼苗(锻炼和驯化)，直接移载到大田，在变温、低湿、强光、有杂菌的自然条件下，会很快失水、萎蔫而死亡。因此，试管苗要逐步驯化适应，以提高成活率。
 
<b>六、仪器使用</b>
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法详见“专题一：微生物培养基的配制”。
 
<b>七、思考探究</b>
MS培养基可以为植物组织培养提供哪些营养物质？
水分、无机营养(包括大量元素和微量元素)、有机营养(包括维生素、氨基酸、有机添加物等)、植物生长调节物质(常用的有生长素和细胞分裂素)。　　常用的植物激素包括两大类：一类是生长素，另一类是细胞分裂素。常用的生长素有2，4－D、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)等。常用的细胞分裂素有：激动素(KT)、6－苄基腺嘌呤(6－BA)、玉米素(ZT)等。
 
不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可使用与本实验相同的细胞分裂素和生长素浓度？
不同植物、不同组织的生根和生芽对生长素和细胞分裂素浓度的需求是不一样的。因此，不可贸然使用与本实验相同的细胞分裂素和生长素浓度。可以参考已发表文献，也可自己探索。
 
本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为什么?
植物中存在的天然激素都有相应的使之分解的酶，这样，天然激素在植物体内作用和存在的时间就较短，而人工合成激素在植物中没有相应的分解它的酶，所以作用和存在的时间长，作用效果明显。
 
外植体在培养过程中可能被污染的原因有哪些？实验过程中你采取什么措施保证植物样本不被污染？
外植体消毒不彻底，培养基灭菌不彻底，接种中被杂菌污染，锥形瓶密封性差等。(1)操作环境清洁，(2)植物样本洁净，(3)操作敏捷迅速。
 
5.本实验应注重实验操作过程，你是怎么做的?
(1)对接种操作中污染情况的分析：
接种3～4天后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。
 
(2)是否完成了对植物组织的脱分化和再分化?
观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈伤组织及愈伤组织的出愈率。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。
 
(3)如何进行统计、对照与记录?
做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度(参考下表)。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，分组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比较。
实验记录表：
192430
 
(4)生根苗的移栽是否合格?
生根苗移栽技术的关键在于既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。培养基基质要提前消毒，可以向培养基基质喷洒质量分数为5％的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜后24h才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再定植到大田或进行盆栽。可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。

<b><font color="#0070C0">专题四　天竺葵的组织培养</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　植物组织培养是指(　　)
A.离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织
B.愈伤组织培育成植株
C.离体细胞培养成植株
D.愈伤组织形成高度液泡化的组织
<b>答案：</b>C
<b>解析：</b>植物组织培养是指在无菌和人工控制(如一定的营养和激素等)的条件下，诱导离体的植物器官、组织等(称为外植体)在适宜的培养条件下发育成完整植株的技术。C项符合植物组织培养的概念，A项为植物组织培养过程中的脱分化，B项为再分化。植物组织培养过程中高度液泡化的组织形成愈伤组织。
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　MS培养基和培养微生物的培养基的主要区别是(　　)
A.MS培养基一般含植物激素，微生物培养基不含植物激素
B.MS培养基不需要氨基酸，微生物培养基需要各种氨基酸
C.MS培养基含维生素，微生物培养基不含维生素
D.MS培养基不需要碳源，微生物培养基含碳源
<b>答案：</b>A
<b>解析：</b>MS培养基含有大量元素、微量元素、有机物，有机物包括甘氨酸、维生素B<sub>1</sub>、维生素B<sub>6</sub>、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂等，特别包括植物生长素和细胞分裂素等植物生长调节物质；微生物培养基不含植物激素。MS培养基含氨基酸如甘氨酸，有碳源如蔗糖，含维生素B<sub>1</sub>、维生素B<sub>6</sub>。微生物培养基中并不是都含有氨基酸，根据微生物代谢类型而异，有些微生物在生长发育过程中可自行合成，可以不加，有些微生物合成能力有限，氨基酸可多加。

<b><font color="#0070C0">专题五　水果的发酵加工——制作果酒和果醋</b></font>
<b>一、实验目的</b>
说明果酒和果醋制作的原理，设计制作果酒和果醋的装置，完成果酒和果醋的制作。
 
<b>二、实验原理</b>
果酒的制作离不开酵母菌，其异化作用类型是兼性厌氧型。在有氧条件下，酵母菌有氧呼吸，大量繁殖；在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵。反应式如下：
226781
影响酒精发酵的主要环境条件有温度、pH、氧气等。酒精发酵时一般将温度控制在18~25℃，20℃左右最适宜酵母菌繁殖。在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境受到抑制。
醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足的时候，才能进行旺盛的生理活动。变酸的酒的表面观察到的菌膜就是醋酸菌在表面大量繁殖而形成的。在氧气和糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；在缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，并进一步转变成醋酸。醋酸发酵的最适宜温度为30~35℃。反应式如下：
235253
 
<b>三、基础知识</b>
1.利用微生物的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵，包括有氧发酵和无氧发酵，所以发酵不能等同于无氧呼吸。
2.葡萄酒是以葡萄为原料酿造而成的，酒精含量为体积分数10%~12%
。由于酿造工艺不同，葡萄酒可分为红葡萄酒和白葡萄酒。
3.在葡萄酒等果酒的生产中，酵母菌发挥了重要作用。在葡萄的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。它们在厌氧条件下可将葡萄汁中葡萄糖的分解为酒精，当酒精浓度达到生产要求后，即可得到葡萄酒。
4.果酒与果醋制作的比较：
239151
提醒：
①醋酸菌和酵母菌二者最适生长温度不同的原因是由于不同生物中不同酶的最适温度不同。
②酵母菌在条件适宜时进行“出芽生殖”，条件不利时进行孢子生殖(有性生殖)。
 
<b>四、实验操作</b>
制作葡萄酒：
1.对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒。先用温水反复冲洗几次，再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，晾干待用，或用开水煮沸后冷却晾干待用。
2.取成熟的紫色葡萄清洗干净并沥干水备用。清洗葡萄时，要连果柄一起在清水中轻轻漂洗，避免损伤葡萄。
3.将洗净的葡萄切成小块或榨成葡萄汁，移入有盖的发酵瓶中，盖好瓶盖。注意放入的葡萄糖块或果汁量不要超过发酵瓶总体积的273298。
4.将发酵瓶置于适宜的温度下发酵，每隔一段时间轻轻拧松瓶盖放气(注意不是打开瓶盖，防止杂菌污染)，直至葡萄皮的色素进入葡萄汁，溶液呈现紫红色为止。10~12天以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。整个过程注意无菌操作。
制作葡萄醋：
5.取适量制成的葡萄酒倒入1只大广口瓶中，并加入刚刚制取的新鲜葡萄汁，利用空气中的醋酸菌或在发酵液中加入适量醋酸菌，将装置转移至30~35℃的条件下醋酸发酵，适时向发酵液中充气。如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口盖上纱布，将发酵瓶置于清洁、无尘、避光处或无菌培养箱中发酵7~8天，观察发酵产生的葡萄醋。
 
<b>五、注意事项</b>
1.葡萄不要反复冲洗，因为葡萄皮上分布有野生型酵母菌菌种。
2.果酒果醋制作过程中都要注意无菌操作，防止杂菌污染，导致实验失败。
3.为满足相应的发酵条件，葡萄汁装入发酵瓶时要留有大约273536的空间，目的是为了让酵母菌有氧呼吸快速繁殖形成优势种群，消耗尽氧气后再进行酒精发酵；其次，防止发酵过程中产生CO<sub>2</sub>造成发酵液的溢出。
4.在葡萄酒等果酒的生产中，还广泛使用果胶酶和蛋白酶等酶制剂。果胶酶的应用有利于葡萄的榨汁等。蛋白酶的应用主要是为了促进蛋白质的水解，使酒体清澈透明。
5.在果汁发酵制作果酒和果醋的过程中，为提高果酒制作的效果，可以适当加入培养在质量分数为5%的葡萄糖溶液中的酵母菌，为提高果醋的制作效果，也可直接加入经过分离培养的醋酸菌。
 
<b>六、仪器使用</b>
制作果酒果醋可用的发酵装置有两种，一种是带盖的广口玻璃瓶或带盖塑料瓶，另一种是带有充气口、排气口和出料口的发酵装置，如图所示。
带盖的广口玻璃瓶或塑料瓶在酒精发酵过程中需要12h左右拧松瓶盖放气一次。醋酸发酵时拧开瓶盖，盖上纱布。
带有充气口、排气口和出料口的发酵装置，充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO<sub>2</sub>的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染，其作用类似巴斯德的鹅颈瓶。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。
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<b>七、思考探究</b>
1.你认为应该先冲洗葡萄还是先除去果柄？为什么？
应该先冲洗，然后再除去果柄，以避免除去果柄时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
 
2.你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
需要从发酵制作的过程进行全面的考虑。例如，榨汁机、发酵装置要清洗干净；酒精发酵时每次排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。
 
3.制作葡萄酒时，为什么要将温度控制在18~25℃？制作葡萄醋时，为什么要将温度控制在30~35℃？
温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30~35℃，因此要将温度控制在30~35℃。
 
4.制作葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？
醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。
 
5.如何评价果酒、果醋的制作是否成功?
判断果酒制作是否成功，可在发酵后取样，通过嗅味和品尝进行初步鉴定。还可用显微镜观察酵母菌，并用重铬酸钾检验酒精存在与否。判断果醋制作是否成功，首先通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝进行初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵前后的pH作进一步鉴定。还可用显微镜观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量作进一步鉴定。

<b><font color="#0070C0">专题六　豆制品的发酵加工——制作腐乳</b></font>
<b>一、实验目的</b>
说明腐乳制作过程的科学原理，设计并完成腐乳的制作，分析影响腐乳品质的条件。
 
<b>二、实验原理</b>
腐乳是一种经过毛霉、曲霉、酵母菌等微生物发酵的大豆食品，豆腐的主要营养成分是蛋白质和脂肪，在毛霉等多种微生物分泌的蛋白酶和脂肪酶的作用下分解成小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸等营养成分，易于被人体消化吸收且有很好的味道。
制作腐乳的主要生产工序是将含水量70%的豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵的主要变化是毛霉在豆腐(白坯)上的生长，发酵温度为16℃左右，使豆腐表面被一层菌膜包住，形成腐乳的“体”，毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于将豆腐中的蛋白质水解。后期发酵的实质是酶参与生化反应的过程，通过用食盐腌制并加入各种辅料(黄酒、红曲、辛香料等)，使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。
 
<b>三、基础知识</b>
1．关于毛霉
腐乳制作过程中，参与的主要微生物是毛霉，它是一种真菌，属于真核生物，其繁殖方式为孢子生殖。它与原核生物(乳酸菌等)的主要区别是它有成形的细胞核。毛霉生长的最适温度为16℃左右，其生长大致分为三个阶段：孢子萌发阶段、菌丝生长阶段、孢子形成阶段。毛霉的营养方式为腐生，新陈代谢类型是异养好氧型。毛霉的菌丝初期为白色，后期呈灰白色至黑色。毛霉能产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，可利用蛋白酶制作腐乳。
2．腐乳制作中盐的作用
(1)析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，在后期发酵过程中不会过早酥烂。
(2)抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。
(3)适量的食盐能给腐乳以必要的口味。
3．腐乳制作中料酒和辛香料的作用
(1)料酒能抑制杂菌的生长，也使腐乳具有独特的香味。
(2)辛香料能调节风味，也有防腐的作用。
4．影响腐乳品质的条件
(1)食盐：食盐的浓度过高，影响口味；浓度过低不足以抑制微生物的生长，豆腐易腐败变质。从容器内取出腐乳坯，用食盐水清洗，然后用食盐腌制10天左右。
(2)料酒：料酒的含量控制在12%左右。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟的时间延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
(3)发酵温度及时间：前期发酵温度为16℃左右，此温度不适于细菌、酵母菌等杂菌的生长，而适于无霉慢慢生长。
(4)辛香料：具有调味和杀菌的作用，也会影响腐乳风味或质量。
 
<b>四、实验操作</b>
(一)工业上批量生产腐乳
1．接种孢子
豆腐切成4cm×4cm×1．5cm的小块(腐乳坯)，将其均匀竖放在蒸汽消毒的笼格内，块与块间隔约1cm，再用喷枪向腐乳坯上喷洒毛霉孢子悬液，使其均匀接触腐乳坯。
2．培养与晾花
培养温度：约20℃。晾花：培养44～48h后，取出笼格，使热量和水分散失，腐乳坯迅速冷却。晾花的目的：增强酶的作用，并使霉味散发。
3．压坯与装坛
将腐乳上的菌丝分开，用手指在其表面涂抹一遍，装入瓶内，撒盐，使含盐量平均约为16%，腌制3～4天时需加盐水淹没坯面，称为压坯。冬季腌制约13天，夏季约8天，然后装坛。可在装坛时添加黄酒，称为醉方，添加红曲的，称为红方。
(二)制作腐乳实践
1．制作腐乳坯
将含水量70%的豆腐切成4cm×4cm×1．5cm的小块，沸水消毒晾干，成为腐乳坯。毛霉来源是空气中的毛霉孢子。
2．装入容器
腐乳坯放入清洁的容器内，间隔约1cm，与容器内壁之间留有空隙，但要与外界相通，以便通气散热，有利于毛霉生长，毛霉生长的最适温度为16℃左右。
3．定时观察毛霉生长状况
表面出现白色毛绒状菌丝后，翻动腐乳坯，以保证腐乳坯各部分都有毛霉生长。当菌丝变成淡黄色，形成灰褐色孢子时，可停止发酵。整个过程尽可能做到无菌操作，若发现杂菌应重做。
4．配置腐乳浸液
腐乳浸液主要包括水、料酒和辛香料筹。料酒的作用是抑制杂菌生长，也使腐乳具有独特的香味；辛香料的作用是调节风味，也有防腐的作用。
 
<b>五、注意事项</b>
1．控制发酵温度
毛霉的最适生长温度为16℃左右，保持适宜温度，可缩短发酵时间。
2．控制发酵中的杂菌
所有器械要沸水消毒或高压蒸汽灭菌，加入辅料后，将瓶口用酒精灯灭菌后再密封，装瓶过程中操作要迅速小心。
3．注意豆腐中的含水量
豆腐含水量以70%为宜。毛霉为异养需氧型真菌，若含水量过高，影响毛霉的有氧呼吸；若含水量过低，则不利于毛霉的生长，毛霉的代谢也离不开水。
4．腐乳酿造选择优良毛霉菌种的条件
(1)不产生毒素，菌丝细软、棉絮状，色白或淡黄；(2)生长繁殖快速，且抗杂菌力强；(3)生产的温度范围大，不受季节限制；(4)有蛋白酶、脂肪酶、肽酶及有益于腐乳质量的酶系；(5)使产品气味正常良好。
 
<b>六、思考探究</b>
1．在日常生活中，人们通常能够将鱼和肉腌制起来长时间保存，其原因是什么？
在高浓度盐水溶液中细菌脱水死亡。
 
2．什么样的豆腐适合于做腐乳？为什么?
含水量适中(70%左右)。含水量过高腐乳不易成型。
 
3．制作腐乳时，一般将酒精含量控制在12%左右，过高过低都不行，为什么?
酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
 
4．影响腐乳品质的主要因素有哪些?
(1)菌种活力和杂菌污染(菌种是生产发酵的关键，如果菌种退化则表现出生化功能的变化，如水解速率、代谢产物等都会发生变化，从而影响品质。如有杂菌污染则直接影响产品的色、香、味)。
(2)温度(温度影响菌丝的生长和代谢，如温度过低，则菌丝生长缓慢，不能进人豆腐块的深层；温度高，菌丝易老化和死亡，影响品质。温度还影响生化反应速度)。
(3)发酵时间(发酵时间影响生化反应速度及生化产物的量)。
(4)调味品(加入的盐、各种酒类、香辛料、糖类等辅料的多少也对口感有重要影响)。
 
5．你认为在整个制作过程中，有哪些操作可以防止杂菌的污染?
(1)长毛时的温度，(2)加盐腌制，(3)卤汤中的酒精、辛香料，(4)对用具的消毒灭菌，(5)密封。
 
6．制作腐乳的发酵过程中，豆腐中有机物的数量和种类分别发生了什么变化?
有机物的数量减少，但其种类增加。这是由于蛋白质和脂肪等有机物部分被氧化分解，转变成小分子的肽、氨基酸、甘油和脂肪酸等。

<b><font color="#0070C0">专题五　水果的发酵加工——制作果酒和果醋</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　如图是利用酵母菌发酵生产酒精的简易装置图，请据图回答：
276973
(1)为什么要用煮沸又冷却的葡萄糖溶液？
____________________。
(2)盛有清水的试管在此发酵实验中有何作用？
____________________。
(3)容器中溶液A一般是指________，发酵实验过程中，描述两试管分别发生的现象。盛清水试管：________；溶液A试管：________。
(4)随着时间推移，盛清水试管的现象最终消失，这是因为________，此时测定烧瓶中溶液的成分应该是________。
(5)本实验主要验证________。
<b>答案：</b>(1)煮沸的目的是为了排尽圆底烧瓶中原有的空气，为酵母菌发酵营造无氧环境，同时对烧瓶、温度计、葡萄糖液进行灭菌；冷却是为了避免酵母菌在高温下失活，为酵母菌提供发挥最高活性的适宜温度
(2)防止氧气回流进入圆底烧瓶抑制酵母菌发酵
(3)澄清石灰水　　有气泡溢出　　溶液变浑浊
(4)葡萄糖逐渐耗尽　　酒精
(5)酵母菌发酵可产生CO<sub>2</sub>
<b>解析：</b>根据装置和原料可知，该过程是酒精发酵，又知酒精发酵需在无氧条件下进行，所以葡萄糖溶液要煮沸以排出瓶底气体并对装置及溶液进行灭菌；由于酵母菌酒精发酵的最适温度一般为18~25℃，所以要将煮沸的葡萄糖溶液冷却以避免酵母菌在高温下失活。澄清石灰水是检测CO<sub>2</sub>的常用试剂，遇CO<sub>2</sub>会出现浑浊现象。
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　生物技术在食品加工中的应用十分广泛，如果酒、果醋的制作就是生活中常见的例子。如图是果酒制果醋的发酵装置，请分析回答：
(1)在果醋发酵过程中，要向发酵瓶中通入空气，原因是________；制醋过程中，将温度严格控制在30~35℃，原因是________。
(2)果酒制果醋的反应式为：__________。
(3)在果醋发酵过程中，用________证明是否有醋酸生成。
(4)在果醋的制作中，提供碳源的物质主要是________。
283773
<b>答案：</b>(1)醋酸菌是好氧细菌　　醋酸菌的最适生长温度是30~35℃
(2)C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>OH＋O<sub>2</sub>289398CH<sub>3</sub>COOH+H<sub>2</sub>O
(3)pH试纸检测流出液的pH
(4)葡萄糖或乙醇
<b>解析：</b>本题主要考查果酒和果醋制作的实验流程及所涉及的物质变化和条件控制，对应分析如下：
290278
 
<b><font color="#0070C0">专题六　豆制品的发酵加工——制作腐乳</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　以下四种微生物都参与豆腐的发酵，从代谢类型上考虑哪一项与其他三项有明显区别(　　)
A．青霉
B．酵母菌
C．曲霉
D．毛霉
<b>答案：</b>B
<b>解析：</b>生物代谢类型包括同化作用与异化作用。四种生物全为真核生物，同化作用类型都为异养型，不同的是酵母菌的异化作用类型是兼性厌氧型，而其他三项全为需氧型。
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　腐乳味道鲜，易于消化、吸收，是因为其内主要含有的营养成分是(　　)
A．无机盐、水、维生素
B．氯化钠、氨基酸、甘油和脂肪酸
C．多肽、氨基酸、甘油和脂肪酸
D．蛋白质、脂肪、氯化钠、水
<b>答案：</b>C
<b>解析：</b>豆腐的主要营养成分有蛋白质和脂肪。在毛霉等多种微生物分泌的蛋白酶和脂肪酶的作用下分解成小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸等营养成分。
 
<b><font color="#0070C0">例3</b></font>　下列关于腐乳制作原理的叙述，不正确的是(　　)
A．腐乳发酵是多种微生物共同参与完成的
B．发酵过程分为前期发酵和后期发酵
C．发酵后期，蛋白质被蛋白酶水解成小分子的肽或氨基酸
D．发酵过程中，毛霉、曲霉等微生物为互利共生关系
<b>答案：</b>D
<b>解析：</b>参与腐乳发酵的微生物主要有毛霉，其次还有酵母菌、曲霉等，这些微生物抢夺共同的资源和空间，它们之间的关系是竞争，而不是互利共生。腐乳制作的实质是利用酶的专一性，将豆腐中不易吸收的大分子物质转变成易于吸收的小分子物质。

<b><font color="#0070C0">专题七　泡菜制作和泡菜中是否含有亚硝酸盐</b></font>
<b>一、实验目的</b>
尝试制作泡菜，学习测定泡菜中亚硝酸盐的方法——比色法。
 
<b>二、实验原理</b>
制作泡菜时，泡菜液中含有乳酸菌、硝酸盐还原菌和其他杂菌。乳酸菌可使蔬菜发酵。泡菜中有大量维生素C，易被人体吸收；盐浓度高以及酒可抵制杂菌生长，防止泡菜发霉、变质，所以在泡菜水中要加盐和白酒；一般制作泡菜用的小白菜和萝卜等蔬菜，含有硝酸盐，硝酸盐还原菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐含量先是不断升高(6天左右亚硝酸盐含量可以达到最高峰)，而在10天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降，这是由于随着腌制时间的延长，乳酸菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，影响其生长繁殖，并且乳酸菌可以降解亚硝酸盐，所以造成泡菜中亚硝酸盐的含量后期有所下降，一般在15～20天内降到安全范围内。所以泡菜必须等到15天以后方可使用。
乳酸菌是一类非致病性细菌，在其发酵过程及产物中不形成任何毒素或毒性产物。
乳酸菌分解大白菜中的单糖、二糖后产生的乳酸使pH下降，发酵产生的二氧化碳使发酵容器中处于厌氧状态，从而阻止食品受其他微生物的侵染导致腐败变质，起到延长食品保存期的作用。同时发酵过程中产生的二氧化碳、醋酸、乙醇、髙级醇、芳香族酯类、醛类、硫化物等赋予了酸菜的风味。
待测样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1－萘基乙二胺偶合形成紫红色染料。将显色反应后的待测样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
 
<b>三、基础知识</b>
1.乳酸菌发酵：
(1)乳酸菌的种类很多，在自然界中分布广泛，新陈代谢类型是厌氧异养型。
(2)在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。反应式是C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>O<sub>6</sub>→2C<sub>3</sub>H<sub>6</sub>O<sub>3</sub>
(3)制作酸奶、泡菜常用到乳酸菌，制作泡菜时要保证无氧的环境。
2.亚硝酸盐的主要特点：亚硝酸盐是一类化学物质，主要指亚硝酸钾和亚硝酸钠，呈白色或淡黄色晶体状，易溶于水，其外观及味道都与食盐相似。亚硝酸盐常用于各种染料的生产，也作为防冻剂使用，常称为“工业用盐”。
3.亚硝酸盐的来源：食品是人体摄入亚硝酸盐的主要来源。
4.亚硝酸盐对人体的危害：亚硝酸盐不仅是具有一定的毒性的物质，还是一种致癌物质。据研究，食道癌的发病率与人体摄入的亚硝酸盐量呈正相关性。孕妇如食用了亚硝酸盐，在体内产生的有毒物质能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。六个月以内的婴儿对亚硝酸盐特别敏感，婴儿所患的“高铁血红蛋白症”就是因食用亚硝酸盐或硝酸盐浓度高的食物引起的。
5.亚硝酸盐使人中毒的原理是由于亚硝酸盐进人血液后能将正常携带氧的血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，高铁血红蛋白失去携氧能力，导致组织缺氧。
6.测定泡菜中亚硝酸盐含量的原理是亚硝酸盐与显色剂对氨基苯磺酸和N－1－萘基乙二胺等体积混合)反应形成紫红色溶液。将显色反应后的待测样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
7.计算亚硝酸盐的含量：①按照公式计算样品中亚硝酸盐的含量。
373980
②计算算术平均值。
 
<b>四、实验操作</b>
1.制作泡菜
(1)原料加工：将洗净的萝卜、白菜、卷心菜、甘蓝、豆角、莴苣、芹菜、辣椒等加工成条状、片状或块状，沥干或晾干待用。
(2)配制盐水：用冷却的沸水加适量的盐和糖配制泡菜液。可在泡菜液中添加调料，包括辅料(白酒、料酒和辣椒等)和辛香料(八角、花椒、胡椒等)，以形成独特的风味。
(3)制作泡菜：将加工好的蔬菜装入瓶中，压紧，注人制备好的泡菜液至刚好浸没原料，密封容器，置于阴凉处自然发酵7～10天。蔬菜上带有乳酸菌、酵母菌等微生物。在制作泡菜的过程中，乳酸菌等微生物分解有机物产生乳酸等物质，这些物质相互作用，使得泡菜带有特殊的酸味香气。
(4)建议分三个时间段，分别制作A、B、C三坛泡菜(一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降)。
2.配置试剂
称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用，配置成硼砂饱和溶液；
称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000mL，配置成亚铁氰化钾溶液；
称取220.0g乙酸锌，加30mL冰醋酸溶于水，并稀释至1000mL，配置成乙酸锌溶液；
称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL质量分数为20%的盐酸中，置棕色瓶中，避光保存，配制成对氨基苯磺酸溶液(4g/L)；
称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶解于100mL蒸馏水中，混匀，避光保存，配制成盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)；
亚硝酸钠标准溶液(200μg/mL)：准确称取0.1g于硅胶干燥器24h的亚硝酸钠，加水溶解后定容到500mL；
亚硝酸钠标准使用液(5.0μg/mL)：临用前用移液管吸取亚硝酸钠标准溶液5.0mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至200mL刻度线处。
3.制备标准显色液(移液管吸取梯度亚硝酸钠－重氮化反应－显色反应)
吸取0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL亚硝酸钠标准使用液(相当于1.0μg、3.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠)，分别加入6支50mL比色管；再取一支加蒸馏水作为空白对照。在各比色管中分别加入2.0mL对氨基苯磺酸溶液，混合均匀后静置3min，再分别加人1.0mL的盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，添加蒸馏水使各比色管内溶液总体积为50.0mL，混合均匀后观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化。
4.制备样品处理液
称取5.0～10.0g泡菜，经榨汁机粉碎、过滤后，置于50mL烧杯中，加12.5mL硼砂饱和液，搅拌均匀，用约300mL70℃左右的热水将样品洗人500mL容量瓶中，于沸水中加热15min，冷却至室温，边转动容量瓶边加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质，最后加水至500mL刻度线处摇匀，放置0.5h，再次过滤，滤液(样品液)备用。
5.比色进行样品测定
吸取40.0mL上述样品液于50mL比色管(有塞)中，向样品液中加入2mL对氨基苯磺酸溶液(4g/L)，混匀，静置3～5min，加人1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，加蒸馏水至50mL比色管的刻度线处，混匀，静置15min。比较样品液和亚硝酸钠标准液的颜色，可粗略确定样品中的亚硝酸钠含量。
 
<b>五、注意事项</b>
1.亚硝酸盐在通常情况下对人体无害，但人体摄入过量时，会引起中毒、甚至引起死亡。只有在特定条件下(适宜的pH、温度和一定的微生物的作用)，亚硝酸盐才会转变成致癌物质——亚硝胺。
2.配置试剂的实验用水应采用蒸馏水，试剂应采用杂质比化学纯试剂更少的分析纯试剂。
3.对于含油脂较多的样品，可除去提取液中的上层油脂，对于有色样品可用氢氧化铝溶液脱色后用于测定。
4.若需进一步确定样品中的亚硝酸钠的精确含量，可采用分光光度计测定波长538nm处各个样品的吸光度，对照一系列亚硝酸钠标准显色液进行同样的测定，即在波长538nm处的吸光度，便可确定泡菜样品中亚硝酸钠的精确含量。计算公式如上(见“基础知识”7)。
 
<b>六、仪器使用</b>
1.泡菜坛的选择方法
做好泡菜的关键就是要选择好的泡菜坛子，选购泡菜坛的关键就是其密封性。泡菜坛口突起，坛口周围有一圈凹形托盘(水槽，用来盛水)，做泡菜时要在托盘内装满水密封坛子，防止空气进人。如没有泡菜坛，也可用别的容器代替，但要求容器口大而密封严密，不能透气。泡菜坛本身质地好坏，对泡菜与泡菜盐水有直接影响，故用泡菜坛子一定要预先进行严格的检査。
2.选坛子的方法
一是将坛子压在水内，查看坛子内壁有无砂眼、裂纹而导致渗水现象。以无渗水现象为好。
二是在坛沿上渗入清水一半，将草纸一卷燃烧后放入坛内，盖上坛盖，能把坛沿水吸人坛盖内壁者，证明泡菜坛质量较好；反之则差。
三是用手击坛，用耳听声，呈钢音者质量好，呈空响、砂响、破音者则次。
 
<b>七、思考探究</b>
1.为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长或变质的蔬菜?
答：有些蔬菜，如小白菜和萝卜等，含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久发生变质(发黄、腐烂)或者煮熟后存放太久，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。
 
2.食物中的亚硝酸盐是如何产生和变化的？
答：发酵初期，泡菜中的微生物生长很快，微生物将蔬菜中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐的含量会逐步上升。随着微生物代谢活动的持续，氧气被消耗殆尽，泡菜坛中的环境不利于除乳酸菌以外的其他微生物的生长。另外，随着乳酸菌的增多，乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用增强，因此，亚硝酸盐的含量会逐渐下降并趋于一个相对稳定的数值。
 
3.配置试剂的实验用水能否用自来水替代蒸馏水?
答：不能。因为自来水中可能有亚硝酸盐。
 
4.制备样品处理液的过程中，加硼酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌溶液的目的是什么?
答：除去样品滤液中的杂质，使泡菜液透明澄清，以便后续的显色反应。
 
5.样品测定的时间应该如何控制?
答：由于重氮反应(亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生的反应)不稳定，显色后颜色不断加深，因此控制在15min比色比较好。
 
6.亚硝酸盐可转化成致癌物质，为什么在食品生产中还可以用作食品添加剂?
答:膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体内以过客的形式随尿液排出，只有在特定条件下才能转变成致癌物——亚硝胺，即亚硝酸盐在许可范围内对身体健康不会造成危害。

<b><font color="#0070C0">专题八　蔬菜在腌制过程中维生素C含量的变化</b></font>
<b>一、实验目的</b>
1.探究发酵食品(如泡菜)中维生素C含量的变化。
2.了解蔬菜在腌制过程中维生素C含量与亚硝酸盐的积累呈负相关性。
 
<b>二、实验原理</b>
维生素C具有很强的还原性，能还原染料2，6-二氯靛酚溶液(简称DCIP)，本身则氧化为脱氢型。2，6-二氯靛酚溶液在中性或碱性溶液中呈蓝色，而在酸性溶液中呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成微红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型维生素C量成正比。
 
<b>三、基础知识</b>
1.维生素C
维生素C是不饱和多羟基物，分子式为C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>6</sub>，其结构式如右图，分子中的烯二醇基具有还原性。维生素C是一种水溶性维生素，
在常态下不稳定，容易被空气中的氧所氧化，易受温度、pH、酶、铜离子、铁离子、紫外线以及糖、盐等的影响，因此，掌握维生素C含量的变化成为判断果蔬耐储藏性和新鲜程度的重要指标之一。
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维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸(ascorbicacid)。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有对化学致癌物的阻断作用。由于维生素C在人体内不能合成，因此必须从食物中摄取。它分布很广，许多水果、蔬菜中的含量丰富。
早年航海人员常因缺乏维生素C患坏血病而死亡。坏血病开始的时候症状是四肢无力，精神消退，烦躁不安，易疲惫，皮肤易红肿。病人会觉得肌肉疼痛，精神抑郁。然后脸部肿胀，牙龈出血，牙齿脱落，口臭。皮肤下大片出血。最后是严重疲惫、腹泻、呼吸困难，骨折，肝肾衰竭而致死。
近年来随着化肥的大量使用，导致蔬菜中硝酸盐含量增加，就硝酸盐本身来说，对人类并无直接危害，而一旦它被还原成亚硝酸盐后，对人体的健康就会产生危害。亚硝酸盐为强氧化剂，进入人体后，可使血中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，使血红蛋白失去携氧能力，致使组织缺氧，并对周围血管有扩张作用。亚硝酸盐的危害不只是使人中毒，它还有致癌作用。亚硝酸盐可以与食物或胃中的仲胺类物质作用转化为亚硝胺。亚硝胺具有强烈的致癌作用。因此，泡菜中亚硝酸盐的含量变化逐渐引起人们的重视。
多项实验结果表明：由于维生素C能阻止亚硝酸盐的合成，维生素C含量与亚硝酸盐的含量呈负相关性。泡菜制作过程中，常见的腌制方法会将蔬菜中维生素C大量破坏。通过添加一定量的大蒜、生姜能降低亚硝酸盐，提高维生素C含量，提高泡菜产品的食用安全性。
2.滴定分析法
一种分析溶液成分及含量的方法。将标准溶液逐滴加入被分析溶液中，用颜色变化、沉淀或电导率变化等来确定反应的终点。滴定分析法是一种历史悠久的测定维生素C的方法。常用的滴定法有碘量法、电位滴定法、库伦滴定法及2，6-二氯靛酚溶液滴定法等。此方法具有仪器设备简单、操作快速方便等优点，但滴定法最低检出限较高，且依靠显色确定滴定终点的滴定法不能测定有色提取液的维生素C含量。
3.标准液
即已知准确浓度的溶液。可用待测物质标准溶液(维生素C标准溶液)的滴定值绘制成工作曲线或作为计算标准，为待测样品中该物质含量的测定提供参考依据。
 
<b>四、实验操作</b>
1.材料、用具及仪器药品
(1)材料准备：制作泡菜，每天相同时间取样。
(2)用具及仪器：研钵或捣碎机，100mL锥形瓶、50mL容量瓶，10mL移液管、5mL移液管，100mL量筒，滴定管，漏斗、滤纸，电子天平。
(3)试剂：
2%草酸溶液：草酸2g溶于100mL蒸馏水。
1%草酸溶液：草酸1g溶于100mL蒸馏水。
标准维生素C溶液(0.1mg/mL)：准确称取50.0mg纯维生素C(应为洁白色，如变为黄色则不能用)溶于1%草酸溶液中，并稀释至500mL，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。
2，6_二氯靛酚溶液(0.1%)：250mg2，6-二氯靛酚溶液溶于150mL含有52mgNaHCO<sub>3</sub>的热水中，冷却后加水稀释至250mL，贮于棕色瓶中冷藏(4°C)，可保存约一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。
2.制备泡菜提取液
称取适量(20g)样品，加等量的2%草酸溶液，研磨成匀浆。过滤两次，取一定量移入50mL容量瓶中，用2%草酸溶液将样品稀释至刻度，摇匀。或者研磨后以2%草酸洗涤离心(4000r/min，10min)2～3次，合并上清液于50mL容量瓶中，定容至刻度。
3.标准液滴定
准确吸取标准维生素C溶液1mL置50mL锥形瓶中，加9mLl%草酸，摇匀，以0.1%的2，6-二氯靛酚溶液溶液滴定至淡红色，并保持15s不褪色，即达终点；取10mLl%草酸作空白对照，按以上方法滴定。由所用染料的体积计算出lmL染料相当于多少毫克维生素C。
4.样品滴定
准确吸取滤液两份，每份10mL，分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10mL1%草酸作空白对照滴定。
5.计算样品中维生素C的含量
计算公式：
388856
式中：V<sub>A</sub>为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；
V<sub>B</sub>为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；
C为样品提取液的总毫升数；
D为滴定时所取的样品提取液毫升数；
T为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数(由“实验操作3”计算出)；
W为待测样品的质量(g)。
连续统计20天的数据，绘制蔬菜在腌制过程中维生素C含量的变化，交流讨论。
 
<b>五、注意事项</b>
1.由于许多果品、蔬菜都含有花青素、叶绿素和胡萝素等色素物质，其维生素C提取液通常都有颜色，致使用2，6_二氯靛酚滴定法等方法测定维生素C含量时，滴定终点不易辨别。所以，这类方法不适于花青素含量高的果蔬(如山楂、树莓、草莓、苋菜等)的维生素C测定。但对于橘、苹果、梨、葡萄、白菜等花青素含量较低的果蔬，2，6-二氯靛酚溶液滴定法可以获得比较可靠的测定结果。
2.某些水果、蔬菜浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。尽量除去皮、核等部分，保留可食用的部分。
3.将果蔬组织彻底粉碎，使组织中的维生素C充分溶解出来，以免造成所测定出的维生素C含量与实际含量有较大误差。建议使用多功能食物粉碎机粉碎果蔬组织。用2%草酸溶液来冲洗粉碎机内残存的果蔬组织，以减少组织提取液的损失。
4.整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。
5.标准维生素C溶液和被检测的果蔬组织提取液的pH，必须调至3左右，以保持溶液的酸性环境，防止维生素C被破坏。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。
6.滴定过程中，要保持缓慢滴定，同时要晃动锥形瓶。接近终点时，更要放慢滴定的速度。
7.每次实验前，都要重新滴定标准维生素C溶液。因为每次所配制的2，6-二氯靛酚溶液溶液之间可能存在着微量的差异，这种差异将导致所用的2，6-二氯靛酚溶液溶液的量不同。
 
<b>六、仪器使用</b>
1.滴定管的构造特点
滴定管分酸式滴定管和碱式滴定管，滴定管上边的刻度小(有0刻度)，下边的刻度大。可精确到0.01mL。
2.酸碱滴定管使用时的注意事项及方法
使用时先检查是否漏液；读数前要将管内的气泡赶尽、尖嘴内需充满液体；读数需有两次，第一次读数时必须先调整液面在0刻度或0刻度以下；读数时，视线、刻度、液面的凹面
最低点在同一水平线上；实验时，边观察实验变化，边控制用量。量取或滴定液体的体积＝第二次的读数－第一次读数。
 
<b>七、思考探究</b>
1.为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤?
答：选材时应该选取含有花青素、叶绿素和胡萝素等色素物质少的蔬菜进行腌制；研磨时应使组织中的维生素C充分快速地溶解出来，建议使用多功能食物粉碎机粉碎果蔬组织；标准维生素C溶液和被检测的果蔬组织提取液的pH保持酸性，防止维生素C被破坏；每次实验前，都要重新滴定标准维生素C溶液。
 
2.若用泡菜提取液滴定一定体积一定浓度的2，6-二氯靛酚溶液时，如何确定滴定终点?
答：用泡菜提取液滴定等量的相同浓度的2，6-二氯靛酚溶液，原来2，6-二氯靛酚碱性溶液呈蓝色，若被蔬菜提取液中的维生素C还原则变为无色。所以可以把2，6-二氯靛酚溶液由蓝色变为无色作为滴定的终点。
 
3.本实验若没有维生素C标准样品，如何绘制维生素C的变化曲线?
答：泡菜发酵过程中，取不同发酵时间的等量泡菜制成相同体积的提取液，用相同浓度的2，6-二氯靛酣溶液进行滴定，以达到滴定终点的2，6-二氯靛酚溶液溶液用量作为不同发酵时间下泡菜中的维生素C的相对含量，以此数据绘制维生素C的变化曲线。虽然误差较大，但也能看出泡菜制作过程中维生素C含量的变化趋势。

<b><font color="#0070C0">专题七　泡菜制作和泡菜中是否含有亚硝酸盐</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　下列有关亚硝酸盐的叙述中，正确的是(　　)
A．亚硝酸盐只存在于自然环境中
B．只在蔬菜类食品中能检测出亚硝酸盐
C．在食品加工过程中也会产生亚硝酸盐
D．含有亚硝酸盐的肉类、蛋类不能食用
<b>解析：</b>在自然环境和蔬菜类食品中都能检测出亚硝酸盐；含有少量(不超过我国卫生标准规定的量)亚硝酸盐的肉类、蛋类可以食用；在食品加工过程中也会产生亚硝酸盐。
<b>答案：</b>C
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　某同学在泡菜腌制过程中每隔3～4天测一次亚硝酸盐的含量，其结果如下表：
395167
(1)本实验所用测定亚硝酸盐含量的方法是________。
(2)下列关于亚硝酸盐含量测定原理的描述，正确的是(　　)
A．重氮化——酸化——显色——比色
B．重氮化——酸化——比色——显色
C．酸化——重氮化——显色——比色
D．酸化——重氮化——比色——显色
(3)在下图中绘出1号坛泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化图。
414703
(4)结合曲线和表中数据分析亚硝酸盐含量变化的原因。
 
 
(5)3个泡菜坛亚硝酸盐含量为何有差别？原因何在？在泡菜腌制过程中应如何减少亚硝酸盐的含量？
<b>解析：</b>本实验的原理是在弱酸条件下，发生重氮化反应后才能与显色剂发生反应，然后与已知浓度的标准显色液进行比较，估算出亚硝酸盐的含量。此外，解答时应注意分析各种数据的变化趋势，而不是着眼于某一个具体数值。亚硝酸盐的含量变化与腌制泡菜中的杂菌数量有密切的关系，杂菌越多，亚硝酸盐含量越高。
<b>答案：</b>(1)比色法　(2)C
(3)
418652
(4)由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于杂种细菌的繁殖(包括一些硝酸盐还原菌)，这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，同时，乳酸菌降解亚硝酸盐的作用增强，造成泡菜中亚硝酸盐的含量有所下降。
(5)3个泡菜坛中亚硝酸盐含量，2号坛最少，最多的为3号坛。3号坛亚硝酸盐含量多的原因可能是泡菜腌制的过程中被污染。在泡菜腌制过程中注意腌制时间，控制好温度和食盐用量。
 
<b><font color="#0070C0">专题八　蔬菜在腌制过程中维生素C含量的变化</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　为了比较蔬菜中维生素C的含量，黎明同学根据维生素C可使2，6-二氯靛酚碱性溶液退色的原理，设计了如下实验：在四只同样的试管中分别加入了2mL相同浓度的2，6-二氯靛酚碱性溶液，然后用滴管分别向其中滴加黄瓜、青椒、芹菜、白菜的汁液，观察结果如下：
424322
据表可知，四种蔬菜的维生素C含量不同，那么由多到少依次是(　　)
A．①②③④
B．②④①③
C．③①④②
D．④③②①
<b>解析：</b>本实验是用蔬菜提取液滴定等量的相同浓度的2，6-二氯靛酚碱性溶液，原来2，6-二氯靛酚碱性溶液呈蓝色，若被蔬菜提取液中的维生素C完全还原则变为无色。到达滴定终点的蔬菜提取液体积用量越少，说明该蔬菜提取液中维生素C含量越高。所以本题应选B。
<b>答案:</b>Ｂ
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　某同学用滴定分析法测定泡菜中维生素C含量时，滴定前碱式滴定管中未将气泡赶尽，滴定后气泡消失。请问此操作是否正确？对维生素C含量测定结果有何影响？
<b>解析：</b>不正确操作：未将滴定管中的气泡赶尽，滴定后气泡消失。直接后果：经读数后计算出的体积并非实际滴定用标准溶液的体积。V(标)增大，使最后的结果偏高。

<b><font color="#0070C0">专题九　制备果胶酶并观察其作用</b></font>
<b>一、实验目的</b>
1.体验从植物材料中提取果胶酶的过程。
2.观察果胶酶对果蔬匀浆的澄清作用。
 
<b>二、实验原理</b>
果胶广泛存在于髙等植物特别是水果和蔬菜的组织中，是植物细胞间质以及细胞壁的重要成分，在植物的细胞或组织间起黏合作用，它的分解将会引起细胞之间的离散。成熟的植物果实中，果胶酶含量增多，它能够水解果胶质，使果胶质最终分解成半乳糖醛酸，使果实细胞的胞间层水解，细胞间松散，组织软化。
新鲜的果汁匀浆中由于大量果胶溶于水而呈黏稠状，使果汁混浊。在果胶酶的作用下，果胶被分解成半乳糖醛酸，果汁变澄清。可以通过对比加入果胶酶前后果汁的澄清度和过滤后果汁量(或出汁率)，来观察果胶酶对果蔬匀浆液的澄清作用。
酶活力的高低受到温度、pH、激活剂等多种因素的影响。从植物材料中提取果胶酶在低温、偏酸性的提取液和NaCl作激活剂的条件下进行。
 
<b>三、基础知识</b>
(一)酶的性质和酶的活力
酶是两性电解质，能在电场中移动；酶的水溶液具有亲水胶体的性质，不能通过半透膜；酶分子易受一些物理因素(如高温、紫外线等)和化学因素(如酸、碱、有机溶剂等)的作用而变性，从而丧失活力。
酶活力也称为酶活性，是酶在催化一定的化学反应时表现出来的能力，通常用酶促反应的速率，即酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。
 
(二)果胶与果胶酶
果胶是存在于所有高等植物细胞壁和细胞间隙中的一种结构多糖，与植物组织中的纤维素、半纤维素、木质素以及蛋白质、无机盐离子等相互交联，使细胞组织结构坚固。果胶酶具有水溶性，其分子量为5万～30万。
果胶酶是一个多酶复合体系，是所有能够分解果胶的酶的总称。
 
(三)影响果胶酶活性的因素
果胶酶活性受温度、pH、激活剂等多种因素的影响，处于低温、偏酸性和NaCl作激活剂条件下，酶活性最高，而果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。
 
<b>四、实验操作</b>
1.制备果胶酶
(1)将50g新鲜的水果或蔬菜洗净，在0～4℃冰箱中保存一昼夜，用剪刀迅速剪碎后，加入预冷的质量分数为10%的NaCl溶液50mL，用榨汁机制作成匀浆液。
(2)在漏斗中放置一层滤纸过滤或用5层纱布过滤匀浆液，收集滤液。
(3)以4000r/min的离心速率离心滤液15min。注意使用同一规格的离心管，离心管内滤液的高度不超过离心管长度的549342，离心前要确保在离心机中对称放置的离心管(内含滤液)的质量相等。
(4)离心完毕后，果胶酶主要存在于离心管的上清液中，迅速将上清液倒入洁净的小烧杯中，用0.1mol/L冰醋酸将pH调至3～4，在0～4℃冰箱中保存备用。
 
2.观察果胶酶对苹果匀浆液的作用
(1)用榨汁机将苹果果肉制成匀浆液，将匀浆液置于90℃恒温水浴锅保温4min，使苹果汁中的酶失活，冷却后用3层纱布过滤，收集滤液，成为苹果匀浆液。
(2)取5mL含果胶酶的上清液置于90℃恒温水浴锅保温4min，使上清液中的酶失活。冷却后备用。
(3)取两只试管，编号为1、2，分别加入5mL苹果匀浆液，同时向试管1中加入含果胶酶的上清液5mL，向试管2中加入90℃灭活的上清液5mL。
(4)在大烧杯中加入40℃、100mL水，将两支试管一起水浴保温，观察、比较和记录两支试管的澄清过程。待试管中苹果匀浆液出现明显澄清现象时，同时取出两支试管，用单层滤纸过滤，收集滤液，并用量筒量取过滤后的果汁量，过滤时间为3min，将实验结果记录在表格中。(过滤后果汁澄清度可以用“＋”数目的多少表示)
549738
 
<b>五、注意事项</b>
1.实验过程中，对照管2的设置是在5mL苹果匀浆中加入90℃恒温水浴处理后的上清液5mL，而不是加入5mL蒸馏水。因为上清液为果胶酶的粗提取液，其中还有多种未知成分，故用90℃恒温水浴处理灭活后的上清液为对照。还可以避免由于加入蒸馏水后，稀释了果汁，对过滤后的果汁量和澄清度有影响。
 
2.本实验中的粗提取酶液来自成熟水果匀浆离心后的上清液，其中还可能含有纤维素酶、淀粉酶等酶，而作为底物的果汁匀浆中，除了纤维素和果胶外，一般还含有维生素A、B、C，果酸(柠檬酸，水杨酸，苹果酸……)，果糖，葡萄糖，蔗糖，还有少量的酯类、芳香烃、淀粉、蛋白质、脂肪，以及钙、磷、铁等元素。果汁匀浆浑浊的主要原因是由于含有大量果胶，但也有其他因素。果汁澄清的主要原因是果胶酶水解了果胶，但也不是唯一原因，还包括淀粉酶水解了淀粉和纤维素酶水解了纤维素。
 
<b>六、仪器使用</b>
中学生物学实验室一般使用的是中低速(＜8000rpm)台式离心机。离心机使用时离心管和转头的正确使用是非常关键的，尤其是离心管的对称放置和质量配平，同时应该注意离心管和转头可以承受的最大质量的溶液，液体最多装至离心管体积的568924。
 
<b>七、思考探究</b>
1.为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理？
答:可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免苹果泥和果胶酶的混合是防止影响果胶酶的活性。
 
2.为什么能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低?
答:果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反应了果胶酶的催化分解果胶的能力。在一定的温度和pH范围内，果胶酶的活性越大，苹果汁的体积就越大。
 
3.在探究温度对果胶酶活性的影响时，哪个因素是变量，哪些因素应该保持不变?
答:温度是变量，果泥量、果胶酶的浓度和用量、水浴时间和混合物的pH等其他条件不变。只有这样才能保证只有温度一个变量对果胶酶的活性产生影响。
 
4.在探究温度或pH的影响时，是否需要设置对照？如果需要，又应该如何设置？为什么?
答:需要设置对照实验，不同的温度梯度之间或不同的pH梯度之间就可以作为对照，这种对照称为相互对照。

<b><font color="#0070C0">专题十　探究洗衣粉中的酶在洗涤中的作用</b></font>
<b>一、实验目的</b>
说出加酶洗衣粉的洗涤原理；探讨不同种类的加酶洗衣粉对同一污物和不
同污物洗涤效果的区别。
 
<b>二、实验原理</b>
普通洗衣粉中不含酶，加酶洗衣粉中含有多种酶，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等。洗衣粉中的蛋白酶能水解如血渍、奶渍等蛋白质类污垢，脂肪酶能水解脂肪类污垢。
 
<b>三、基础知识</b>
1.污垢成分主要包括蛋白质类污垢如奶渍、血渍；脂肪类污垢如油垢；淀粉类污垢如面条、巧克力、土豆泥、粥等。
2.化学洗涤剂的去污能力主要来自表面活性剂。
3.加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶和纤维素酶。
4.蛋白酶是洗涤剂中最常用的一类酶制剂，它能将蛋白质分解成可溶性多肽。洗衣粉是碱性的，因此加在洗衣粉中的蛋白酶都应是碱性蛋白酶。
5.脂肪酶将脂肪水解为较易溶解的甘油和游离的脂肪酸；淀粉酶能将淀粉迅速水解为可溶性的麦芽糖、糊精等。纤维素酶虽不能直接去除衣物上的污垢，但能使纤维的结构变得蓬松；纤维素酶还能去除棉纺织品表面的浮毛。
6.加酶洗衣粉由于含有生物活性酶，在最适条件(温度、pH)下洗涤效果较好。
 
<b>四、实验操作</b>
1.选择实验材料
本实验中可选用的加酶洗衣粉的种类是蛋白酶洗衣粉，复合酶洗衣粉和普通洗衣粉(不含酶)。
2.制备布料
选择的污物类型分别是油渍、血渍、汗渍，取12块10cm见方的正方形白棉布，分成三组，每组4块。第一组的4块滴等量的油滴，形成油渍；第二组的4块滴等量的鸡血，形成血渍；第三组的4块擦拭出汗部位如鼻翼两侧，形成汗渍。分别晾干或吹风机吹干。每组留一块作对照。
3.控制实验变量
本实验中确定的变量为洗衣粉类型和污渍类型，通常用水温控制在30～50℃的自来水溶解加酶洗衣粉、复合酶洗衣粉和普通洗衣粉。
4.实施实验过程
(1)实验材料分组编号；
(2)配制洗衣粉溶液：
取1000mL大烧杯9个，分三组，标记为1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3、3-1、3-2、3-3；分别加入500mL温水；第一组各加入蛋白酶洗衣粉1.5g，第二组各加入复合酶洗衣粉，第三组各加入无酶洗衣粉1.5g，搅拌，使其溶解。
(3)对照下表分组洗涤，并记录实验结果，与预留的三块不同污渍的白棉布进行比对。请据表分析：
569320
5.得出实验结论
对油渍洗漆效果较好的是哪种洗衣粉？对汗渍洗涤效果较好的是哪种洗衣粉？对血渍洗涤效果较好的是哪种洗衣粉？
 
<b>五、注意事项</b>
1.选择白色棉布实验效果好，用化纤布料不易体现加酶洗衣粉的洗涤效果。
2.实验过程中洗涤方法均选择手洗或均选择机洗，手洗和机洗时间均为2min。尽量保持无关变量相同，减少误差。
 
<b>六、思考探究</b>
1.在这个实验设计中你认为最重要的研究方法是什么？使用这样的研究方法要注意什么？
答：是对照实验法。要注意控制单一变量。
 
2.使用加酶洗衣粉时应注意哪些事项？
答：(1)碱性蛋白酶能使蛋白质水解，因此蛋白质类纤维(羊毛、蚕丝等)织物就不能用加酶洗衣粉洗涤；
(2)选择适宜的水温，例如碱性蛋白酶在35～37℃时活性最强，在低温下或70℃以上就会失效；
(3)加酶洗衣粉不宜长期存放，存放时间过长会导致酶失活；
(4)加酶洗衣粉能分解人体皮肤表面的蛋白质，从而导致人患过敏性皮炎、湿疹等，因此应避免与这类洗衣粉长期接触。
 
3.为什么说加酶洗衣粉能减少对环境的污染？
答：加酶洗衣粉可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，使洗涤剂朝低磷、无磷的方向发展。
 
4.在本课题中可以用什么方法和标准判断洗涤效果?
答：略。

<b><font color="#0070C0">专题九　制备果胶酶并观察其作用</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　下列说法不正确的是(　　)
A．在探究果胶酶用量的实验中，需设置酶的用量梯度
B．植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶
C．通过测定滤出的苹果汁的体积大小无法来判断果胶酶活性的高低
D．人们使用果胶酶、纤维素酶等来解决制作果汁面临的问题
<b>解析：</b>在探究果胶酶用量的实验中，参照研究温度和pH对酶活性的影响实验，釆用梯度测定法，只是将原实验中的pH梯度和温度梯度改成酶的用量梯度而已，即A正确；植物、霉菌、酵母菌和细菌在其生活过程中，都会发生分解果胶的过程，因此，它们都可产生果胶酶，故B正确；在制作果汁过程中，由于果胶、纤维素的存在，影响榨出的果汁量及果汁的透明度，加入纤维素酶和果胶酶后，果汁榨出量及透明度均有提高，即D正确；在使用梯度测定酶的用量及活性时，可以通过榨出的苹果汁的体积大小来判断，因此C错误。
<b>答案：</b>C
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提髙水果的出汁率，为研究温度对果胶酶活性的影响，某学生设计了如下实验：
594549
Ⅰ：将果胶酶与苹果泥分装于不同试管，在10℃水浴中恒温处理10min(如图甲)
Ⅱ：将步骤I处理后的果胶酶和苹果泥混合，再次在10℃水浴中恒温处理10min(如图乙)
Ⅲ：将步骤Ⅱ处理后的混合物过滤，收集滤液，测果汁量(如图丙)
Ⅳ：在不同温度条件下重复以上实验步骤，并记录果汁量，结果如下表：
610731
根据上述实验，请分析回答下列问题：
(1)果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以把细胞壁中的果胶分解为________。
(2)实验结果表明，当温度为________左右时，果汁量最多，此时果胶酶的活性________。
(3)为什么该实验能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？
________。
(4)下列A、B、C3幅图依次表示果胶酶浓度一定时，果胶酶的反应速度与反应物浓度、速度、pH之间的关系，请据图完成下列问题：
627689
①图A中，反应物达到某一浓度时反应速度不再上升的原因是__________。
②图B中，曲线ab段表明__________，曲线bc段表明__________。
③将装有果胶酶与反应物的甲、乙两支试管分别放入12℃和90℃水浴锅中，20min后取出转入40℃的水浴锅中保温，两支试管内的反应是：甲__________，乙__________。
④图C表示果胶酶浓度、反应物浓度、温度等一定时，果胶酶催化反应的速率随pH变化的曲线，实验时可根据__________来判定果胶酶的最适pH。
<b>解析：</b>(1)果胶酶催化植物细胞壁中的果胶分解成为半乳糖醛酸。
(2)由题干中的表格可知，40℃时果汁量最多，说明此温度下酶活性最强。
(3)该实验中衡量结果的指标有两项，一是观察在相同的时间内，滤出苹果汁的体积的多少。体积多说明果胶酶活性高，将果胶分解得多，使果汁更好地流出。二是观察果汁的澄清度。
(4)酶是生物体内具有催化能力的有机物，绝大多数是蛋白质，其催化效率受反应物浓度、温度、pH的影响。
①图A中，当反应物在低浓度范围内增加时，反应速度迅速上升；当反应物达到一定浓度时，随反应物浓度增加，反应速度不再增加。这是因为酶虽然有高效性，但催化能力也有一定限度，当所有酶都发挥了最高效能后，反应物浓度再增加，反应速度也不增加，这时受酶浓度的影响。
②从a点到b点曲线上升，这是因为温度升高，酶活性升高。曲线bc下降，因为温度超过最适温度，酶活性降低。
③由于甲试管温度较低，所以酶活性较低，反应速度很慢，当转入40℃(酶反应的适宜温度)的水浴锅中加热时，其反应速度迅速增加。乙试管在90℃高温下，酶结构被破坏，酶变性失活，当转入40℃的水浴锅中保温时，酶活性也不再恢复，故无催化反应。
④图C表示果胶酶浓度、反应物浓度、温度等一定时，果胶酶催化反应的速率随pH变化的曲线，实验时可根据果汁的量来判定果胶酶的最适pH。
<b>答案：</b>(1)半乳糖醛酸
(2)40℃；最大
(3)果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反映了果胶酶催化果胶分解的能力。
(4)①受反应物中酶浓度的限制
②果胶酶的活性随温度升髙而升高；果胶酶的活性随温度的继续升高而下降
③反应速度加快；无催化反应
④果汁的量
 
<b><font color="#0070C0">专题十　探究洗衣粉中的酶在洗涤中的作用</b></font>
<b><font color="#0070C0">例1</b></font>　下列关于加酶洗衣粉的说法，不正确的是(　　)
A．加酶洗衣粉的效果总比普通洗衣粉的效果好
B．加酶洗衣粉效果的好坏受很多因素的影响
C．加酶洗衣粉中目前常用的酶制剂有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶
D．加酶洗衣粉相对普通洗衣粉更有利于环保
<b>解析：</b>加酶洗衣粉与普通洗衣粉相比，虽然表面活性剂和三聚磷酸钠的含量较少，但添加了一定量的酶制剂。在酶的作用下，构成污渍的一些生物大分子被分解为可溶性的小分子，使污迹容易从衣物上脱落，即加酶洗衣粉的洗涤效果不仅没有降低，反而加强了。但是，由于酶具有专一性，只有洗衣粉中的酶与污渍相对应时，其优势才能发挥出来。如果不对应，加酶洗衣粉的洗涤效果可能不如普通洗衣粉。
<b>答案：</b>A
 
<b><font color="#0070C0">例2</b></font>　加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。请回答下列问题：
(1)由下图推知，该实验的目的是__________，50℃时加酶洗衣粉中碱性蛋白酶的最适含量是__________。
637780
(2)下表是添加脂肪酶的加酶洗衣粉和普通洗衣粉洗涤效果的实验记录，请据表回答问题：
649823
①该实验设计体现了________原则。
②若实验组1号洗净所需时间接近7min，最可能的原因是________。
(3)下列衣料不适宜用添加蛋白酶的加酶洗衣粉洗涤的有________。
①棉织品
②毛织品
③腈纶织品
④蚕丝织品
(4)根据以上实验结果，写出两项提高加酶洗衣粉洗涤效果的措施：________(写出两项合理答案即可)。
<b>解析：</b>由题图可知，实验中存在两个变量：温度与碱性蛋白酶含量，即实验探究的是温度、碱性蛋白酶含量对去污力的影响。在50℃时，洗衣粉的去污力在碱性蛋白酶含量为0.6%时达到最大，由表中数据可知，1、3号为实验组，2、4号为对照组，1、2号与3、4号中只有是否加酶一个变量，该实验过程体现了对照原则和单一变量原则。若实验组1号加酶后洗净时间接近7min，很可能的原因是酶已经失活。蛋白酶可分解蛋白质，故毛织品、蚕丝织品等以蛋白质为主要成分的衣料不能用含蛋白酶的加酶洗衣粉洗涤。用温水浸泡(提高酶的活性)，延长浸泡时间(增加酶的催化时间)，增加酶的用量等都可以提高加酶洗衣粉的洗涤效果。
<b>答案:</b>(1)探究温度、碱性蛋白酶含量对去污力的影响；0.6％
(2)①对照、单一变量
②酶失活
(3)②、④
(4)用温水浸泡；延长浸泡时间；增加洗衣粉的用量等

专题十一　酵母菌细胞的固定化技术
一、实验目的
尝试固定化酵母菌细胞的制备和应用。
 
二、实验原理
固定化酶是指利用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。通过固定化技术将酶加以改造固定，既保持了酶的催化性能，又具有一般催化剂能反复利用的优点，并在生产过程中可以实现酶促反应的连续化和自动化。
通过各种方法与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，可以像游离的细胞一样用于发酵生产。该技术免去了破碎细胞提取酶等步骤，能充分利用细胞内的酶，保留了细胞内原有的多酶系统，这样对于多步催化的连续反应优势更明显。
 
三、基础知识
1.酶的特点
除了某些耐受高温的酶和耐受较低pH的胃蛋白酶等以外，大多数酶在高温、强酸和重金属离子等外界因素的影响下，都容易变性失活。
2.加酶洗衣粉中的酶在使用中的不足
酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍具有很高的活力，也难以回收利用。这样一次性使用酶的方式，不仅增加了生产成本，而且难以连续化生产。
3.固定化酶的定义和特点
(1)固定化酶是指利用物理学的或化学的的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶的活性的酶复合物。
(2)在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复利用。酶的催化反应依赖于其活性部位的完整性，因此，在固定某一种酶时必须选择适当的条件，使其活性部位的基团不受影响，如避免高温、强酸、强碱等条件，以免酶变性失活。
4.常用的制备固定化酶的方法
主要是吸附法、交联法、包埋法等。
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制备固定化酶的常用方法可用下图所示：
850682
5.固定化酶在生产实践中的应用
(1)在新型青霉素的生产中具有重要作用。为了解决细菌对青霉素产生的抗药性问题，除了努力寻找新的抗生素外，最有效的办法是改造原有青霉素的结构，以克服细菌所产生的抗药性。要生产各种半合成青霉素，最重要的问题是获得青霉素酰化酶，催化青霉素生产6-氨基青霉烷酸，以便进一步合成新型青霉素。
(2)将葡萄糖酶、过氧化氢酶和某种无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸与尿液相遇时，随尿液中葡萄糖含量的多少而呈现不同的颜色，浅蓝、浅绿、棕色或深棕色等。
(3)采用固定化硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶可以有效地处理含有硝酸盐、亚硝酸盐的地下水或废水。
6.固定化细胞技术的定义及优缺点
(1)通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性的技术。
(2)优点：
①固定化细胞技术无需进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。
②固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。
③对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。
④细胞生长停滞时间短，反应快等。
正因为该技术有无可比拟的优势，尽管它的出现远远晚于固定化酶技术，但它的应用范围比固定化酶更广泛。
(3)缺点：
①固定化细胞只能利用胞内酶，只能用于生产胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。
②由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。
③在好氧细菌发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。
7.制备固定化细胞技术的方法
856671
答案：容器壁　中空纤维　大孔隙或裂缝　外壁　微生物的细胞　不溶于水　凝胶包埋法　微生物、动物和植物　琼脂、海藻酸钠凝胶
8.直接使用酶、固定化酶和固定化细胞优缺点的比较
875165
答案：非常敏感　失活　回收　一系列　酶　下降　与反应物接触　反复
特别提醒：
①固定化细胞时使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。
②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变小，酶活性受外界影响也较小。
③由于细胞个体大，难以吸附或结合，因此常用包埋法；而酶分子很小，易从包埋材料中漏出，因此常用化学结合法和物理吸附法固定。
9.固定化细胞技术的应用
固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。
10.固定化酵母菌细胞的制备流程
活化酵母菌细胞
　　↓
形成酵母菌－海藻酸钠胶液
　　↓
倒入带有孔径为2mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注射针筒中，以恒定的速度滴入饱和硼酸-氯化钙溶液中
　　↓
形成凝胶珠
 
四、实验操作
1.准备各种药品和器具：略。
2.制备麦芽汁：称取一定量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58～65℃下放置3～4h。每隔一定的时间用碘液测定，直至不显色为止，得到麦芽汁。将得到的麦芽汁煮沸、冷却后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121℃下灭菌15min，制成无菌麦芽汁。(也可以用质量分数为10%的葡萄糖溶液代替麦芽汁)
3.活化酵母菌细胞：称取1g干酵母放入50mL小烧杯中，加入蒸馏水10mL，用玻璃棒搅拌，活化酵母菌约1h。
4.制备固定化细胞：称取4g聚乙烯醇(PVA)和0.2g海藻酸钠，加入蒸馏水40mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45℃，加入预加热至35℃的酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌-海藻酸钠胶液；将胶液倒入带有孔径为2mm喷嘴的小塑料瓶或注射针筒中，以恒定的速度滴入预先盛有50mL饱和硼酸－氯化钙溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌－聚乙烯醇－海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。
5.待凝胶珠在溶液中浸泡30min后，取出并用蒸馏水洗涤3次备用。
6.发酵麦芽汁：将固定化酵母细胞凝胶珠加入300mL无菌麦芽汁中，置于25℃下发酵7～9天；若用质量分数为10%的葡萄糖溶液，则在25℃下发酵24h。待发酵结束后品尝其味道。
 
五、注意事项
1.酵母菌细胞的活化：酵母菌细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5～1h。此外，酵母菌细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母菌细胞的活化液溢出容器。
2.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，关系到实验的成败。对海藻酸钠溶化时要小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊；海藻酸钠的浓度关系到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数目少，影响实验效果。
将溶化后的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母菌细胞混合，避免高温杀死酵母菌细胞；固定化酵母菌细胞时，应将海藻酸钠与酵母菌细胞的混合液用注射器缓慢滴加到硼酸－氯化钙溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。
3.刚形成的凝胶珠应在硼酸－氯化钙溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。制作的固定化酵母菌细胞是否合格的检测方法：
(1)观察凝胶珠的颜色，若颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母菌细胞数目较少。
(2)观察凝胶珠的形状：若不是球形或椭球形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。
(3)用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠制作成功。
(4)在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，表明制备的凝胶珠是成功的。
4.凝胶珠在硼酸－氯化钙溶液中浸泡30min后，取出并用蒸馏水洗涤3次备用，防止浸泡时间过长，凝胶珠过硬，影响发酵。
5.固定化酵母菌细胞的制备与应用时应注意：细胞的固定化要在严格无菌的条件下进行；反复使用固定化酵母菌细胞时，要避免微生物污染；在应用固定化酵母菌细胞进行酒精发酵时要注意控制好温度，保证缺氧的环境，并且发酵时间要稍长一些，增强实验效果。
 
六、仪器使用
本实验中用到的仪器有纱布、烧杯、玻璃棒、灭菌锅、小塑料瓶或注射器等。其中纱布用于制备麦芽汁时的过滤。灭菌锅对该实验中所用器材及麦芽汁进行灭菌。用小塑料瓶或注射器将海藻酸钠与酵母菌细胞的混合液缓慢滴加到硼酸-氯化钙溶液中，以形成凝胶珠。
 
七、思考探究
1.为什么麦芽汁可以被质量分数为10%的葡萄糖溶液替代？
酵母菌也能利用葡萄糖进行发酵。
 
2.海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。如何避免？
溶解海藻酸钠最好采用小火间断加热的方法。如加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网上继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。
 
3.为什么说海藻酸钠适用于多种细胞的固定化?
用海藻酸钠包埋法制备固定化细胞，除对细胞无毒性外，还具有操作简便、条件温和等特性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。
 
4.如果配制的海藻酸钠溶液的浓度过高或过低，会对实验结果产生影响吗?
如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数目少，影响实验效果。
 
5.如何检测凝胶珠的质量是否合格?
—是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
 
6.为什么在工业生产中，细胞的固定化是在严格无菌的条件下进行的？如果要求制作反复使用的固定化细胞，应该在实验过程中注意哪些问题？
防止在细胞的固定化过程中受到污染，导致细胞死亡，使酶失效；在实验过程中，应注意对实验操作的空间、操作者的衣着和用品进行清洁和消毒。还要将用于细胞培养的器皿等各种器具进行灭菌。在操作时还应在酒精灯火焰附近进行，同时实验操作应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
 
7.固定化酵母菌细胞技术有哪些优点？
固定化细胞技术无需进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高；细胞生长停滞时间短，反应快等。正因为该技术有无可比拟的优势，尽管它的出现远远晚于固定化酶技术，但它的应用范围比固定化酶更广泛。

<b>例1</b>　下图为固定化酶的反应柱示意图，其中①为反应柱，②为固定化酶，③为分布着小孔的筛板，请据图回答：
892691
(1)关于固定化酶中用到的反应柱，理解正确的是(　　)
A．反应物和酶均可自由通过反应柱
B．反应物和酶均不能通过反应柱
C．反应物能通过，酶不能通过
D．反应物不能通过，酶能通过
 
(2)与一般酶制剂相比，固定化酶的突出优点是：既能与反应物接触，又能与产物分离，能被反复利用，固定化细胞的优点是成本更低，操作更容易。
(3)③的作用是使酶颗粒无法通过，反应液能自由通过。
(4)制作固定化葡萄糖异构酶所用的方法有吸附法、交联法、包埋法(至少两种)。
答案：C
解析：本题考查固定化酶和固定化细胞的优点，需要比较记忆。使用固定化酶技术往往利用一个反应柱，反应柱下端有一个分布着小孔的筛板，颗粒无法通过，而反应液却可以自由出入。而固定化酶就被固定在载体颗粒中。
 
<b>例2</b>　下面是制备固定化酵母菌细胞的步骤，请回答：
酵母菌细胞的活化→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合→饱和硼酸→氯化钙溶液→凝胶珠。
(1)在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母菌细胞活化时体积会增大。
(2)影响实验成败的关键步骤是配制海藻酸钠溶液。如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞数目少；如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠。
(3)观察形成凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明固定化酵母菌细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明海藻酸钠浓度偏高，制作失败。
(4)固定化细胞技术一般采用包埋法固定，原因是细胞个体大，不易从包埋材料中漏出。
(5)制备好的凝胶珠是否符合应用要求，常用的检测方法有(　　)
①挤压法　②摔打法　③观察法　④培养法
A．①②③
B．②③④
C．①③④
D．①②④
解析：本题考查固定化细胞的原理、方法及注意事项。同时考査酵母菌的有关知识，干酵母在无水状态时休眠，条件一旦适宜，其活性马上恢复。用包埋法固定酵母菌细胞的关键是海藻酸钠溶液的配制。海藻酸钠浓度的高低直接影响酵母菌细胞固定的质量，其中饱和硼酸一氯化钙溶液起到了使胶体聚沉、凝胶珠结构稳定的作用。

专题十二　血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
一、实验目的
了解电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。
 
二、实验原理
带电荷的蛋白质等物质，在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动的现象称为电泳。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，血清中各种蛋白质的等电点不同，但大都在7以下(见表1)，若将血清置于pH为8.6的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度也不同，故可利用电泳法将它们分离。蛋白质分子小而带电荷多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、α<sub>1</sub>-球蛋白、α<sub>2</sub>-球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白五条区带，经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。
907558
 
三、基础知识
1.等电点
两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，用符号表为pl(等电点)。此时两性电解质在电场中的迁移率为零。蛋白质也是两性电解质，在PH小于其等电点的溶液中，蛋白质带正电，在电场中向阴极定向移动，在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质带负电，在电场中向阳极移动。
2.醋酸纤维薄膜电泳
电泳法：是指在电场作用下，带电颗粒由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为，从而彼此分离开来的一种实验技术。支持物电泳是目前纯化蛋白质的一种较为普遍的方法。支持物可以是滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶(如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶)等。
醋酸纤维薄膜，是纤维素的羟基乙酸化所形成的纤维素醋酸酯。具有泡沫状的结构，厚度均为120μm，有很强的渗透性，对分子移动阻力很小。实验用的醋酸纤维薄膜是由一层薄薄的聚乙烯和压附在其上的醋酸纤维素酯构成的。光滑一面是聚乙烯一面，粗糙面是醋酸纤维素酯的一侧。采用醋酸纤维薄膜作为支持物进行电泳具有方法简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量少、没有吸附、点样后区带界限清晰等优点，广泛应用于科学实验、临床化验和生化产品的分析(血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白等的分离与鉴定)等方面。
由于醋酸纤维薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低的电流，避免蒸发。
醋酸纤维薄膜电泳的操作流程：
925834
 
四、实验操作
1.配制试剂
(1)巴比妥缓冲液(pH＝8.6)1000mL：称取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g，加水溶解定容至1000mL。
(2)氨基黑染色液100mL：称取氨基黑10B0.5g，溶于甲醇50mL、冰醋酸10mL及水40mL的混合液中。
(3)漂洗液100mL：量取甲醇或无水乙醇45mL、冰醋酸5mL及水50mL，混勻。
(4)透明液100mL：量取冰醋酸30mL、无水乙醇70mL，混匀。
 
2.准备器材
醋酸纤维薄膜(2.5cm×8cm)，常压电泳仪，点样器(可用盖玻片代替)，培养皿，滤纸，玻璃板，镊子，白磁反应板，新鲜血清。
 
3.架滤纸桥
将电泳缓冲液倒入电泳槽两边并用虹吸管平衡两边液面。根据电泳槽的纵向尺寸，剪裁尺寸合适的滤纸条，取四层附着在电泳槽的支架上，使其一端与支架的前沿对齐，另一端则浸入电极槽的缓冲液内。然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。作为联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。
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4.浸泡薄膜
取醋酸纤维薄膜(2.5cm×8cm)，识别光面和毛面，在光面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，做上记号。然后将此薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡20～30min，待充分浸透(即膜条无白斑时)后取出。
 
5.细心点样
取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸之间，吸去多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上，有记号的一面朝下)，用点样器(盖玻片)蘸取适量血清(血清可放在白磁反应板上)，再“印”在薄膜的点样区(距薄膜一端1.5～2cm处)。血清应均勻分布，形成具有一定宽度、粗细匀称的直线。点样切忌过量，可事先在滤纸上练习以掌握点样技术，细心点样是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。
 
6.平悬薄膜
将已点样的薄膜加样面朝下，加样端置于阴极端，平整地贴于电泳槽的支架上(支架上事先放置好两端浸入缓冲液的用四层滤纸条做的“滤纸桥”)并拉直，用慑子将其中的气泡赶出。要求是薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。盖上电泳槽盖。
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7.实施电泳
先平衡10min，至薄膜湿润时方可进行电泳。仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调至90V，预电泳10min，随后再把电压调至130V，夏季通电40～50min，冬季60min左右。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过髙或偏低。待电泳区带展开约3.5cm时，关闭电源。
 
8.染色
电泳结束后，立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5～10min。
 
9.漂洗
将染色完毕的薄膜自染液中取出，直接放人漂洗液中，连续更换漂洗液数次(约3～5次)，直到薄膜背景几乎无色为止。即得五条蛋白色带。
 
10.脱色
若要保存薄膜，待薄膜完全干燥后，置透明液中10～20min，取出贴于玻璃板上，干后则透明，可长期保存。
 
11.对蛋白质进行定量及计算(条件允许，可做)
将漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取一条与各区带近似宽度的无蛋白附着的空白薄膜，分别浸于4.0mL0.4mol/LNaOH溶液中，37°C水浴10min，色泽浸出后，用7220型分光光度计在580～620nm处比色，以空白膜条洗出液为空白调零，测定各管的吸光度。
吸光度总和T为各种蛋白吸光度的总和：Τ＝Α＋α<sub>1</sub>＋α<sub>2</sub>＋β＋γ
分别计算每种蛋白的百分数
清蛋白(％)＝944378×100%
α<sub>1</sub>球蛋白(％)＝944798×100%
α<sub>2</sub>球蛋白(％)＝945259×100%
β球蛋白(％)＝945746×100%
γ球蛋白(％)＝946223×100%
注：A：清蛋白的吸光度；α<sub>1</sub>：α<sub>1</sub>球蛋白的吸光度；α<sub>2</sub>：α<sub>2</sub>球蛋白的吸光度；β：β球蛋白的吸光度；γ：γ球蛋白的吸光度。
现在许多实验室采用光密度计定量法：待薄膜完全干燥后，浸于透明液中约10min，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后成为透明的膜。然后在光密度计上测定吸光密度，并可绘制成曲线，或者直接计算出各种蛋白质的百分含量。
 
五、注意事项
1.薄膜浸泡必须足够长时间，取出薄膜吸取多余的缓冲液时，要注意不能长久放置于滤纸上，否则薄膜过干，影响电泳效果。
2.点样时要注意只需轻轻的点一下，有一条清晰的血清痕迹即可，点样处不能距一端太近，不能重复点样，否则会导致电泳结果不清晰，条带混杂。
3.平悬薄膜时，要注意点样区不能接触到电泳槽支架上的滤纸，且点样区放在阴极端，薄膜必须拉直，中间部分不能与电泳槽接触。
4.电流强度控制需适宜，一般在0.4～0.6mA/cm[总电流量＝电流量(mA/cm×每条膜的宽度(cm)×膜条数]电流条件下电泳，电流强度过高，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中的水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。
5.染色时间需适宜。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不易区分，或造成条带染色不均。
6.漂洗时要注意时间长度，背景色变为灰蓝色即可，过度漂洗会使蛋白质条带也被洗掉，影响最后实验的结果。
7.透明时间需合适，如在透明液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。
 
六、仪器使用
1.电泳仪的简介
电泳仪的主体是电泳槽和电源。电泳槽是电泳系统的核心部分，根据电泳的原理，电泳支持物都是放在两个缓冲液之间，电场通过电泳支持物连接两个缓冲液，不同电泳采用不同的电泳槽。本实验使用水平电泳槽。
要使带电荷的生物大分子在电场中泳动，必须加电场，且电泳的分辨率和电泳速度与电泳时的电参数密切相关。不同的电泳技术需要不同的电压，电流和功率范围，所以选择电源主要根据电泳技术的需要。如聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS电泳需要200～600V电压。醋酸纤维薄膜电泳需要电压较低，在90～150V，电流强度一般控制在0.4~0.6mA/cm。
 
2.电泳仪的使用步骤
(1)首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端连接，注意极性不要接反。
(2)往电泳槽中加入缓冲液。要注意使电泳槽液面要保持水平，缓冲液高度不能超过红色划线，同时要漫过电桥，否则无法形成回路，不能进行电泳。
(3)电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。
(4)接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。
(5)工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拔出电泳插头。
 
七、思考探究
1.为什么说点样是实验中的关键步骤之一？
点样时血清分布不均匀易导致电泳图谱不齐；点样时血清加样量过多易导致电
泳图谱分离不良或中间颜色变浅；点样时血清加样量过少可导致电泳图谱染色过浅。这
些因素会影响蛋白电泳的结果分析。
 
2.点样前要将薄膜表面多余的缓冲液吸去，但又不能吸得太干，为什么？
点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。
 
3.点样为什么要在粗糙面？电泳时为什么点样面要向下放置？
醋酸纤维薄膜是由一层薄薄的聚乙烯和压附在其上的醋酸纤维素酯构成的。光滑一面是聚乙烯一面，粗糙面是醋酸纤维素酯的一侧，所有点样应该在粗糙面。聚乙烯不导电而酯酸纤维素酯能导电，光滑面向下时，由于聚乙烯薄膜的阻挡作用，使通过薄膜的电流减小，血清蛋白流动变慢，从而导致了条带间距变小，实验结果也因此变得不理想。
 
4.如果区带的分离效果不好，试分析可能受哪些因素的影响？
原因很多，可能选择的醋酸纤维薄膜不合规定，浸泡时间不够或太干；划线时用力过大，将膜条弄破或出现凹陷，而影响电泳区带分离的均一性；点样时用力过大、过小。点样时用力太大，将膜条弄破或出现凹凸不平，而影响电泳区带分离效果；点样时用力过小，玻片可能没有与膜片接触，导致点样量太少，则蛋白质量少，区带模糊不清·’点样量不均匀。点样时，玻片必须与薄膜保持垂直，若不垂直，则既可能使点样量过少，又可能使薄膜折断或受损；在用玻片进行点样时，玻片上的样品涂得不均匀，有的地方多，有的地方少，会导致在醋酸纤维薄膜上的样品的量分布不均一，实验的结果也就显示图谱不均一。

专题十三　凝胶色谱法分离血红蛋白
一、实验目的
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
 
二、实验原理
蛋白质的物理、化学性质如形状、大小、电荷性质及其多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，根据这些性质的差异，可以提取和分离各种蛋白质。
 
三、基础知识
1.凝胶色谱法(分配色谱法)：
(1)原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
(2)凝胶材料：多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
(3)分离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子洗脱是指从色谱柱的上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
(4)作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。
 
2.缓冲溶液：
(1)原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐(如H<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>/NaHCO<sub>3</sub>，NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>/Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>等)组成，调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
(2)缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
 
3.凝胶电泳法：
(1)原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力
不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
(2)分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
(3)分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质——SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
 
四、实验操作
1.样品处理
(1)红细胞的洗涤：
洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入5倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤3次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
 
2.粗分离
(1)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
(2)透析：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
 
3.纯化
调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
　　↓
加人蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，打开下端出口，使样品渗人凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，关闭出口。
　　↓
调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度。
　　↓
洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
　　↓
收集、分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。
 
4.纯度鉴定
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
 
五、注意事项
1.红细胞洗涤后如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
 
2.检测凝胶色谱柱的装填是否成功的方法是：由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱平行的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
 
六、思考探究
为什么凝胶的装填要紧密、均匀？
如果凝胶装填得不够紧密均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
 
为什么要沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶?
这样不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。
 
装填完后，为什么要立即用洗脱液洗脱?
目的是使凝胶装填紧密。
 
洗涤红细胞时加人梓檬酸钠有何目的？洗涤时为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
目的是防止血液凝固；低速、短时离心是为了防止白细胞沉淀；缓慢搅拌是防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
 
与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义?
 
如何检测血红蛋白的分离是否成功?
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均勻、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

专题十四　水蒸气蒸馏法提取橘皮中的芳香油
一、实验目的
了解提取植物芳香油的原理，设计简单的实验装置，从橘皮中提取芳香油。
 
二、实验原理
橘皮芳香油具有诱人的橘香味，其主要成分是柠檬烯，是生产食用香精、化妆品香精和医药香精的优质原料。橘皮芳香油存在于果皮油细胞中，不仅挥发性强，能随水蒸气一起蒸发，而且易溶于有机溶剂，如石油醚、乙醚或酒精等，其沸点低于水的沸点。
植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等方法。提取橘皮芳香油可采用水蒸气蒸馏法或旋转蒸发器法。蒸馏时，随着温度的升高和水分的侵入，果皮油细胞涨破，芳香油流出并随水一起形成蒸气，蒸气再通过冷凝器，经导管流入收集瓶。由于油的密度比水小，收集液经静置后，油便浮出水面，再经分液漏斗分离即可得到芳香油。
 
三、知识基础
1.橘皮芳香油的特点
橘皮芳香油具有挥发性，其沸点低于水的沸点，能随水蒸气一起蒸发，可利用蒸馏法将果皮油细胞中的芳香油提取出来，再通过冷凝器，经导管流入收集瓶，由于油轻水重，再分离即可得到芳香油。
 
2.提取植物芳香油的主要方法
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除了上述方法外，植物芳香油的提取还有吸香法、浸泡法。吸香法利用的是油脂可以吸附油剂的原理，所选用的脂肪一般含有猪油和牛油成分，要经过特别处理，以防止变质变臭。浸泡法与吸香法类似，但改用液体的油脂而不是吸香法中用到的膏状油脂，浸泡法常用来提炼树脂、树胶及花瓣中的芳香精油。
 
3.水蒸气蒸馏装置
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蒸锻装置包括蒸馏烧瓶、冷凝器和接收器3个部分。
(1)安装：按照自下而上，从左到右的顺序安装。
(2)蒸馏：蒸馏开始时，先通冷水后加热，蒸馏结束时，先撤热源后停止通水。
(3)拆卸：顺序与安装相反。
 
四、实验操作
(一)蒸馏法提取橘皮芳香油
1.将洗净后的新鲜橘皮切碎与适量的水放入蒸馏瓶，安装好水蒸气蒸馏装置。
2.点燃酒精灯，实施蒸馏，观察并记录实验现象。
3.蒸馏结束后锥形瓶中的收集液经静置后，油便浮出水面，再经分液漏斗分离即可得到芳香油。
 
(二)压榨法提取橘皮芳香油
1.材料准备
准备适量的新鲜的橘皮，清水洗干净，沥干水分后置于干燥通风处。将晾干的橘皮浸泡在pH大于12、质量分数为7%～8%的石灰水中16～24h，其间翻动2～3次。浸泡好的橘皮呈黄色、无白芯、稍硬、脆而不断、具有弹性。这样的橘皮在压榨时不易打滑，橘油的喷射力强，压榨后的残渣呈颗粒状，含水量低，黏稠度不高，过滤时比较顺利，不易堵塞筛孔。
2.粉碎压榨
将浸泡好后的橘皮经流水清洗后粉碎至长、宽3mm大小，放入家用榨汁机或手动压榨机中粉碎。粉碎时加入与橘皮同质量的质量分数为0.25%的小苏打和质量分数为5%的硫酸钠，并调节pH至7～8。
3.过滤离心
在榨出的油水混合液中加人明矾，使之沉淀并变澄清，然后用布袋过滤，除去糊状残渣。再将得到的混合物，用6000～8000r/min的转速进行高速离心。正常情况下，离心后得到的香精油是澄清透明的。
4.除去杂质
分离出的香精油往往带有少量水分和蜡质等牵质，可以将分离的产品放在5～10℃的冰箱中，静置5～7天，让杂质与水下沉。然后用吸管吸出上层澄清的油层，再通过垫有滤纸或石棉纸的漏斗进行减压抽滤，得到黄色油状的橘皮精油。
5.成果评价
可以从颜色、气味等方面来评价所提取的精油的纯度和质量。从橘皮提取的橘皮精油无色透明，具有诱人的橘香味。计算出油率(出油率为芳香油质量/原料质量)，若出油率高则方案合理，若出油率低则应分析实验方法、过程等方面的原因。
 
五、注意事项
1.橘皮在石灰水中的浸泡时间为10h以上。橘皮要浸透，这样压榨时不会滑脱，出油率高，过滤时不会堵塞筛眼。
2.实验中要注意避免石灰水与皮肤接触。
3.为了能将橘皮均匀地浸泡在水中，橘皮可以放入家用榨汁机中粉碎压榨，但要注意安全。
4.为了使橘皮油易于与水分离，还要分别加入相当于橘皮质量0.25%的小苏打和5%的硫酸钠，并调节pH至7～8。
5.提取橘皮精油需要两次过滤：第一次用普通布袋过滤，第二次用滤纸过滤。
6.低温处理必须掌握好温度(5～10°C)和时间(5～7天)。
 
六、仪器使用
如图所示，整套蒸馏装置可分为左、中、右3个部分，其中左边的部分通过加热进行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接收冷凝后的蒸馏物。安装仪器一般都按照自下而上，从左到右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安装顺序和方法如下：
(1)固定热源——酒精灯。
(2)固定蒸馏瓶，保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。
(3)安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。
(4)连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。
(5)连接接液管。
(6)将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接收器，接收瓶应在实验前称重，并做好记录。
(7)将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。
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七、思考探究
1.举例说明提取植物芳香油的3种具体方法。
蒸馏法：适用于玫瑰油、薄荷油、肉桂油、薰衣草油、檀香油等挥发性较强、能随水蒸气蒸发的植物芳香油。压榨法：柠檬油、甜橙油易受机械压力作用而直接榨出。橘皮芳香油既可以采用蒸馏法提取，也可以用压榨法制得。萃取法：茉莉浸膏、桂花浸膏的制取是将新鲜的植物材料浸泡在低沸点的有机溶剂(如乙醚等)中，经一段时间后取出残潼，再蒸去溶剂，即可获得蜡质的膏状物。
 
2.在水蒸气蒸馏装置中，为什么要让冷却水由冷凝管的下方流入，上方流出？
这样可以冷却得更充分。
 
3.如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会如何变化？原因是什么?
下降，因为部分精油会随水蒸气挥发而流失。
 
4.用来提取芳香油的高质量橘皮具有哪些特点?
黄色、无白芯、稍硬、脆而不断、具有弹性等。

专题十二　血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
例　回答有关蛋白质分离和纯化的问题。
(1)要获得血清蛋白的粗制品，必须将含有柠檬酸钠的血液进行离心处理，然后将上清液装入透析袋中除去小分子物质。1004145
(2)要获得血红蛋白，应如何破碎红细胞？加蒸馏水使其涨破。
(3)右图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱，你认为含量最多的蛋白质是清蛋白，含负电荷最多的球蛋白是α<sub>1</sub>-球蛋白，相对分子质量最大的球蛋白是γ-球蛋白。
(4)电泳是目前应用最为普遍的(分离)纯化蛋白质的方法。
解析：本题考查蛋白质分离和纯化的基础知识。
 
专题十三　凝胶色谱法分离血红蛋白
例　血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O<sub>2</sub>和部分CO<sub>2</sub>的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。
(1)将实验流程补充完整：A为＿＿＿＿＿＿＿＿，B为＿＿＿＿＿＿＿＿。凝胶色谱法的基本原理是根据＿＿＿＿＿＿＿＿而达到有效分离蛋白质。
(2)洗涤红细胞的目的是去除＿＿＿＿＿＿，用的是＿＿＿＿＿，洗涤次数过少，无法除去＿＿＿＿＿；离心速度过高和时间过长会使＿＿＿＿＿＿一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志＿＿＿＿＿＿＿＿。释放血红蛋白的过程中起作用的是＿＿＿＿＿＿＿＿。
(3)在洗脱过程中加人物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是＿＿＿＿＿＿＿＿。如果红色区带________，说明色谱柱制作成功。
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解析：本题主要是考査血红蛋白的提取和分离的实验流程。首先要了解血液的成分，才能理解实验目的是去除血浆蛋白等杂质蛋白。洗涤时用生理盐水是因为生理盐水的渗透压与血浆相近，不会导致红细胞破裂。洗脱过程中加人缓冲液的目的是维持pH稳定。检测色谱柱制作成功与否，是看红色区带是否均匀一致的移动。
答案：(1)血红蛋白的释放　　样品的加入和洗脱　　相对分子质量的大小
(2)杂蛋白(血浆蛋白)　　生理盐水　　血浆蛋白　　白细胞和淋巴细胞是离心后的上清液中没有黄色　　蒸馏水和甲苯
(3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致　　均匀一致的移动
 
专题十四　水蒸气蒸馏法提取橘皮中的芳香油
例1　在植物有效成分的提取过程中，常用萃取法、蒸馏法和压榨法，下列关于这三种方法的叙述错误的是(　　)
A.蒸馏法的实验原理是利用水将芳香油溶解下来，再把水蒸发掉，剩余的就是芳香油
B.压榨法的实验原理是通过机械加压，压搾出果皮中的芳香油
C.萃取法的实验原理是使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发掉溶剂后就可获得芳香油
D.蒸馏法适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
解析：蒸馏法是利用水蒸气将挥发性较强的芳香油携带出来，适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油；压榨法通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油，适用于柑、橘、柠檬等易焦煳原料的提取；萃取法使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发掉溶剂后就可获得芳香油，它的适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液中。
 
例2　在蒸馏过程中，要提高产品质量，应该采取的措施是(　　)
A.提高蒸馏温度，延长蒸馏时间
B.提高蒸馏温度，缩短蒸馏时间
C.降低蒸馏温度，缩短蒸馏时间
D.严控蒸馏温度，延长蒸馏时间
解析：用蒸馏法分离植物有效成分时，温度会影响其性质，如果温度过高则破坏其结构，温度过低则分离不出有效成分。如果在一定温度范围内延长蒸馏时间，就可以得到较多的植物有效成分。
 
例3　下列不属于橘皮精油提取中应注意的问题事项是(　　)
A.橘皮在石灰水中浸泡时间为10h以上
B.橘皮要浸透，从而压榨时不会滑脱
C.压榨液的黏稠度要高，从而提高出油率
D.为了使橘皮油易与水分离，可加入相当于橘皮质量0.25%的小苏打和5%的硫酸钠，并调节pH至7～8
解析：橘皮在石灰水中浸泡10h以上，浸透后压榨时不会滑脱，压榨液的黏稠度低，过滤时就不会堵塞筛眼。小苏打和硫酸钠可以促进油和水的分离。

专题十五　目的DNA片段的体外扩增
一、实验目的
1.说出PCR体外基因扩增的基本原理。
2.尝试PCR技术的基本操作和应用。
3.尝试DNA扩增产物的检测技术。
 
二、实验原理
PCR技术，又称为体外基因扩增技术或DNA扩增技术。PCR体外扩增DNA的过程类似生物体内DNA的天然复制过程，两者都需要DNA模板、DNA聚合酶、引物、4种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，但DNA聚合酶和引物的种类等有所不同。
PCR—般要经历25～35次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。
 
1.变性：加热使模板DNA在高温(94℃)下变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段，也叫做解链。模板DNA双链或经PCR扩增形成的DNA双链解离成为单链，以便与引物结合，为下轮反应做准备。
 
2.退火(复性)：溶液温度降至40～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即复性阶段，也叫退火。
 
3.延伸：反应体系温度升至72℃，耐热TaqDNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应，即引物的延伸阶段。在DNA聚合酶的作用下，以4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)为反应原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环“变性→复性→延伸”三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，使DNA扩增量理论上呈指数(2<sup>n</sup>)上升。每完成一个循环需要2～4min，2～3h就能将待扩的目的基因扩增放大几百万倍。
 
三、基础知识
1.PCR技术的原理
(1)概念：PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)
的实验技术。
(2)原理：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3ˊ端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。PCR体外扩增DNA的过程类似生物体内DNA复制的过程。两者都需要DNA模板、DNA聚合酶、引物、4种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，都需要解链和链延伸。所不同的是体内解链是靠解旋酶，体外解链是靠高温变性；体内的引物是RNA片段，体外的引物是DNA片段。
 
2.PCR反应的过程
PCR扩增时向离心管中加人的物质包括：
(1)引物(两种由15～40个核苷酸聚合而成的脱氧核苷酸链，引物的数量需保证满足循环反应的需要)；
(2)反应物(4种脱氧核苷酸)；
(3)DNA聚合酶(常用耐热的Taq聚合酶)；
(4)模板DNA(可来自动物、植物、微生物，也可来自人工合成)；
(5)Mg<sup>2＋</sup> (提供离子条件)；
(6)反应缓冲液(提供反应的溶液体系)。
PCR扩增是在PCR自动扩增仪中进行的。具体反应过程包括3个反应步骤即变性、退火(复性)和延伸。
 
3.实验操作
在实验室中，PCR通常使用离心管，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在离心管中依次加入各组分，再设置PCR仪的循环程序即可。
 
四、实验操作
(－)DNA片段的PCR扩增
1.实验器材准备：PCR仪，台式高速离心机，0.2mLPCR离心管，可调式微量移液器，移液器吸头；模板pGEX－4T质粒DNA，退火温度为56℃的引物1(5’-CACCAATGCTTCTGGCGTCAGG-3’)和引物2(5’-TTGGGAACGCATCCAGGCATTG-3’)，Taq聚合酶，10×PCR扩增缓冲液，物质的量浓度为2.5mmol/L四种dNTP溶液，双蒸水等，全部器材都需经过灭菌。
 
2.向离心管中加样
在超净工作台上用微量移液器将以下试剂依次加入到一个灭过菌的0.2mLPCR薄壁离心管中。每次移取一种试剂后，都要更换移液器上的枪头。
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3.加人Taq聚合酶
将以上溶液煮沸5min后冰浴2min，低速离心，按照1U/μL加入Taq聚合酶。也可以取2支0.2mL的PCR离心管冰浴2min，其中一支管作为对照，另一支管作为扩增。在扩增管中加人上述各种药品，对照管不加模板DNA，其余所加成分与扩增管相同。
 
4.设置扩增DNA片段的反应程序
将微量离心管放到PCR仪中，盖好样品池盖。设置PCR仪的工作参数。
PCR反应参考程序：
94℃预热5min，进人循环程序：94℃，30s→56℃，30s→72℃，30s(重复30次循环)。最后一次延伸条件为72℃，5min。
 
5.运行启动扩增程序，进行目的DNA的扩增
 
6.扩增完毕，置标本在4℃下备用
 
(二)DNA分子的测定
1.配制二苯胺试剂：将配制好的0.1mLB液加人10mLA液中，混匀。
 
2.取一定量的扩增前和扩增后的溶液分别放人两支试管中，加入等量的二苯胺试剂，混匀后观察溶液的颜色。用沸水浴加热上述溶液，随时注意观察试管中溶液颜色的变化。
 
3.根据蓝色的深浅，可以粗略地比较扩增前和扩增后溶液中DNA的含量是否有明显的增加。
 
五、注意事项
1.避免外源DNA等因素的污染：实验所用仪器(微量离心管、枪头等)、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；器皿及工作区域要分开，进行无菌操作。
2.缓冲液和酶分装成小份，并在－20℃低温储存。使用前，将所需试剂从冰箱中拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头就必须更换。
4.严格控制反应温度和时间。
5.安全使用PCR仪。
6.安全使用离心机。
 
六、仪器使用
1.微量离心管的使用方法
在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加人后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部，再放入PCR仪中进行反应。
 
2.PCR仪的使用(以PE480为例)
(1)打开电源开关，仪器进入操作首画面，预热10～15min。
(2)打开样品盖，在要使用的样品孔滴入少量油滴，用于确保扩增管中样品温度的均一性。
(3)旋紧样品管，去除空气间隙，防止热循环过程中样品管滑进样品槽中。盖上样品加热盖。
(4)按照屏幕显示，按FILE键，选择方法，按START键运行。或者点击STEP键，编辑方法文件。对PCR的变性(Seg1)、退火(Seg2)、延伸(Seg3)的目标温度和延续时间进行设定(PE480的延续时间从离目标温度差1℃时计时)，既可使用仪器的默认值，也可重新设定。对反应的变性温度和延伸温度，仪器的默认设置可在1s内达到设定温度，也可通过编程使温度递增速度适当减慢。
(5)设定终止温度和持续时间(Seg4)，通常接受其默认值，温度0℃，时间0s，也可在－5～－1℃进行温度和持续时间的设定，用于扩增产物在仪器中的过夜保存，以防扩增物变性。
(6)对变性、退火、延伸3个阶段温度循环进行单个循环的补充。
(7)设置循环次数(仪器的默认值为25)。
(8)方法存储。
(9)运行存储的方法(也可打印方法参数)。方法中终止温度(Seg4)若设定为负值，即可对扩增样品进行过夜保存。
(10)按STOP键，终止操作。
(11)取出样品用于分析。
 
3.离心机的操作使用步骤及注意事项操作使用步骤：
(1)离心前用天平保证离心管的绝对平衡。
(2)打开电源开关，离心机自检后，开启盖门。
(3)选择所需转头，用扳手安装转头，松紧适当。
(4)装载离心管后，拧好转头盖，按下离心机门盖。
(5)设定好转速、时间和温度后，按下启动按钮开始离心。
(6)离心结束后，开启门盖，拧开转头盖。
(7)取出离心管后，卸下转头，关闭电源开关。
(8)在离心机内仓恢复室温后，擦干内壁。
注意事项：
(1)离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管，另外一支要用等质量的水代替。严禁各种液体或其他杂物进人离心工作室内，否则会损坏主机。
(2)启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。
(3)禁止高速直接起动，必须由低速至高速慢慢起动。离心头在高速运转时，请不要随意打开上盖。
(4)分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。
(5)离心过程中实验者不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检査，及时排除故障。
 
六、思考探究
1.比较PCR体外扩增与生物体内DNA复制的过程，两者有何异同？
1055189
答案：第一列：解旋酶；DNA聚合酶；RNA
第二列：模板；合成子链的原料；
第三列：94℃高温；DNA聚合酶；DNA
 
2.在设置PCR仪的循环程序时，你认为最主要的反应条件有哪些?
答：变性、复性、延伸的温度、时间和循环次数。
 
3.下图简要说明了第一次循环过程和产物，你能否再绘制出第二次循环的产物？
1086936
答案如图：
1127673
 
4.假设PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少个这样的DNA片段？
答案：2<sup>30</sup>＝1073741824
 
5.如果你扩增不成功，失败的可能原因有哪些?
答：基因污染等
 
6.PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速等优点，你知道PCR技术有哪些应用吗?
答：用于遗传病诊断、病原体鉴定、免疫学研究、癌基因探索及治疗、古生物学、刑侦破案等方面。

专题十五　目的DNA片段的体外扩增
例1　DNA的复制需要引物，其主要原因是(　　)
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5ˊ端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3ˊ端延伸DNA链
解析：DNA两条链是反向平行的，为了明确表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(-OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5ˊ端。DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从3ˊ端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3ˊ端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5ˊ端向3ˊ端延伸。
答案：D
 
例2　标准的PCR过程一般分为变性、退火、链延伸三大步，其中退火的温度是(　　)
A．94℃
B．72℃
C．55℃
D．37℃
解析：当温度上升到94℃(90～96℃时，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA，称之为变性；当温度下降到55℃(40～60℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度回升到72℃左右(Taq聚合酶的最适反应温度)，在单链上4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则连接在引物之后，使引物延伸，形成互补的DNA双链，称为链延伸。
答案：C

